小鼠模型中非稳定下颌骨骨折的微创技术

摘要

该协议提出了一种全面有效的分析下颌骨修复的方法。我们描述了一种在小鼠模型中用于非稳定下颌骨骨折的可重复技术，允许分析软骨内骨修复过程，同时将组织损伤和骨丢失降至最低。

摘要

可以在小鼠的下颌部位发生不稳定的骨折，从而可以使用软骨内骨化模式分析骨修复。为了最准确地在 体内反映这一过程，有必要有一个标准化的方案来避免过度的骨质流失和软组织损伤，特别是在下颌骨部位，这是一个以最小进入为特征的解剖部位。据我们所知，我们首次描述了小鼠非稳定下颌骨骨折的微创方案。用异氟醚麻醉成年小鼠，并通过皮下注射接受术前剂量的丁丙诺啡。进行下颌下入路，沿下颌骨下缘切开皮肤。咬肌在骨膜下平面沿下颌支通过骨膜提升器升高。从基底缘到冠状突切迹（在髁突和冠状突之间）进行垂直和完全的支骨折，在基底边缘的盐水血清冲洗下使用压电骨手术装置和剪刀完成下颌支的骨折。皮肤入路通过丝缝合线闭合。这种针对不稳定下颌骨骨折的详细手术提供了一种有效的手术，可最大限度地减少骨质流失和软组织损伤。该技术可确保成功和一致的结果，以准确反映小鼠模型中软骨内骨修复的过程。

引言

骨修复意味着膜和软骨内骨化过程，具体取决于骨折或截骨稳定。稳定骨截骨术或骨折后的骨修复依赖于膜骨化，而不稳定的骨折或稳定性差的截骨术根据软骨内骨化模式进行巩固¹。膜骨修复的特征是通过间充质细胞直接分化成成骨细胞形成骨，而软骨内骨修复涉及形成瞬时软骨模板，该模板分化成成骨细胞形成骨愈伤组织²。

骨修复取决于多种组织和细胞相互作用;它还受部位特异性因素和施加在愈伤组织上的力的影响³.下颌骨是一种支持咀嚼力的移动骨，主要由皮质骨形成。下颌骨修复的过程受骨折部位和方向的影响。众所周知，肌肉和骨膜损伤可能会影响骨巩固以及骨折部位的重要骨质流失 ^4,5,6。

分析软骨内下颌骨修复意味着标准化和可重复的方案，用于有价值、无偏倚的比较。关于文献，只有少数作者报告了小鼠模型 ^3,7 中不稳定下颌骨骨折的方案，并且大多数小鼠模型的前方向在磨牙水平⁸。通过开发这项技术，我们的目标是避免肌肉和骨膜损伤并限制骨折部位的骨质流失，以最好地分析软骨内骨修复的过程，而不会产生混杂因素。此外，开发小鼠下颌骨骨折新技术的目的是最大限度地减少小动物此类手术中常见的术后疼痛和动物死亡。我们首次描述了一种针对小鼠支水平非稳定下颌骨骨折的微创方案。这种体内方案避免了骨折部位的过度肌肉和骨膜损伤或骨质流失，并有助于降低术后疼痛程度和动物死亡风险。

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研究方案

该协议遵循 Imagine Institute 的动物护理指南，并已得到伦理委员会和法国部 （APAFIS 26995） 的验证。

1. 动物

1. 确定每组的动物数量。我们建议每组 12 只动物。确定小鼠的性别和年龄。该方案适用于 6 周龄的 C57BL/6J 小鼠（雄性或雌性）。
2. 在手术前至少 1 周给动物服用营养补充剂凝胶以适应环境。

2. 外科手术

1. 准备所需的材料。高压灭菌器械:剪刀、针头驱动器、镊子、压电骨手术装置的插入物和手机以及电梯。准备无菌手套、丝线缝合线 （4/0）、剃须刀、棉纱布、10% 聚维酮碘溶液、加热台、异氟醚和用于吸入异氟醚的鼻子面罩。
2. 制备 0.1 mg/kg 的丁丙诺啡，在无菌注射生理血清中稀释。手术前 30 分钟用 25G 针头皮下注射丁丙诺啡。
3. 准备加热板（37°C），在其上放置泡沫支撑，并用小针或胶带固定吻部面罩。
4. 将鼠标放入异氟醚槽中进行诱导，异氟醚扩散 （4%）。通过捏住脚趾来测试麻醉深度。在充分感应的情况下，将观察到缺乏踏板反射。
5. 将麻醉的小鼠仰卧在加热板上，加热板上覆盖着保持 37 °C 的无菌区域。将面罩放在鼻子上，连续吸入异氟醚（维持在 2.5%）。用胶带固定鼠标四肢。
6. 双侧涂抹眼部润滑剂，以防止全身麻醉引起的眼睛干涩。剃掉下颌下毛，戴上无菌手套，并用 10% 聚维酮碘溶液和酒精擦拭数次皮肤消毒。
7. 如下所述执行下颌下皮肤入路。
   1. 用微型剪刀从下颌角到下颌骨水平支的 1/3 后 - 2/3 前交界处进行皮肤切口。
   2. 解剖皮下组织以露出咬肌。
8. 使用骨膜电梯从下颌骨下缘插入咬肌附着。
9. 用电梯沿下颌支抬高骨膜下平面中的咬肌。
10. 在下颌骨下缘的盐水血清冲洗（最大 10 mL/min）下，使用压电骨手术装置在下颌骨下缘创建一个小截骨术（3 毫米长），在下颌骨下缘，在下颌骨角前方，在凹陷的后部（图 1， 图 2）。
11. 找到下颌骨的后缘和冠状突切迹（用微型剪刀或镊子），并使用沿下颌支插入的小直剪刀完成骨折，以避免额外的咬肌孔径和损伤。为了使骨折方向正确，请将剪刀垂直于下颌骨的下缘放置。
12. 验证骨折是否完全:在用镊子软活动 2 个骨段期间，应观察两个骨段之间的总活动度。
13. 用丝缝合线 （4/0） 和分离缝合线闭合皮肤入路。骨膜不需要缝合。
    注意:或者，皮肤入路可以用其他不可吸附的缝合线（例如聚丙烯缝合线）缝合。
14. 进行头部外侧 X 光检查以确认骨折的方向（图3）。
    1. 在进行 X 射线检查之前，将鼠标再次放入异氟醚罐中进行短暂的重新诱导。然后，将鼠标伸展，在侧面，头部略微过度伸展以进行 X 射线分析。
    2. 如果骨折过于前方位于下颌磨牙水平或骨折分离下颌角（图4），请观察到骨愈伤组织体积的异常增加。在这些情况下，请将动物排除在研究之外，以避免分析中出现任何偏差。
15. 检查老鼠直到它们恢复意识，然后再将它们放回笼子里。

3. 术后护理

1. 准备一个没有粗磨食物和硬富集的小鼠笼子，以避免任何咀嚼力。
2. 将手术小鼠隔离在单个笼子中第^{1 周，} 直到皮肤完全愈合。术后 1 周，组作雌性小鼠一起在同一个笼子里。
3. 在手术后 4 小时、24 小时、48 小时和 72 小时通过皮下注射丁丙诺啡 （0.1 mg/kg）。
4. 从第 0 天到巩固期结束（即 28 天）的所有术后期间，用软糖凝胶喂养小鼠，以避免骨折的疼痛和继发性移位。
5. 从骨折后第 0 天到第 4 天，早上，注射丁丙诺啡前每天称重小鼠，然后每周 3 次称重，直到动物处死（骨折后 14 天）。
6. 评估术后动物健康状况以优化术后动物护理。使用 表 1 中的评分量表评估动物的术后状态并调整随访。当评分> 1 分时，注射丁丙诺啡，当评分> 3 分和/或尽管食物丰富，但体重减轻>术前体重的 20% 时，必须讨论安乐死（表1）。

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结果

至于 体内 外科手术，为了在小鼠模型中最佳地执行这种不稳定的下颌骨骨折手术，需要特定的学习和训练。

这种治疗不稳定下颌骨骨折的技术允许研究软骨内骨修复过程。安乐死后，在 4% 多聚甲醛中收集下颌骨样本 （24 h）。用 EDTA pH 8 完全脱钙后，切片包埋在石蜡中。进行矢状连续切片，在脱蜡溶液中脱蜡，然后在 Sirus Red/Alcian Blue 染色之?...

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讨论

该技术允许在较短的手术时间（约 10 分钟或更短）内以最小的开放方法在小鼠模型中实现不稳定的下颌骨骨折。这种短时手术限制了动物发病和死亡的风险，尤其是对于小鼠等小动物。为了在软骨内骨修复过程的分析中获得可比的结果，应特别注意在同一方向进行下颌骨骨折，而不会异常分裂下颌角，因为这种不良影响会异常增加骨愈伤组织的体积并延迟巩固期。该下?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine : Buprecare 0.3 mg/kg	Animalcare
Elevator OBWEGESER width 6mm Length 17,5cm	Collin Medical	HA 5905
Forceps : Pad Plate MORIA 11 cm N°5	MORIA	9906
Heating table Bioseblab 55 cm x 33 cm	Bioseblab	707
Needle HOLDER : Micro Halsey Needle Holder - Metal	LABODERM	21,100
Neo Clear	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	109843
Ocry Gel Tube 10 g (eye lubricant)	tvm lab	3.70045E+12
Piezotome 2 ASS FINAL	ACTEON	X57402
Piezotome insert Piezocision PZ3	ACTEON	F87574
Scissors micro	MORIA	MC52
Silk sutures PERMA HAND SEIDE  / MERSILK	ETHICON	REF 18501G
Straight scissors	MORIA	4877A
Vetflurane (isoflurane) 250 ml	VIRBAC	VET066 (Centravet)