Técnica menos invasiva para fratura mandibular não estabilizada em modelos de camundongos

Resumo

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para análise do reparo ósseo mandibular. Descrevemos uma técnica reprodutível para fratura mandibular não estabilizada em modelo de camundongo, permitindo a análise do processo de reparo ósseo endocondral com mínimo dano tecidual e perda óssea.

Resumo

Fraturas não estabilizadas podem ser feitas em locais mandibulares em camundongos, possibilitando assim a análise do reparo ósseo usando um modo de ossificação endocondral. Para refletir com mais precisão esse processo in vivo, é necessário ter um protocolo padronizado para evitar perda óssea excessiva e danos aos tecidos moles, principalmente no local mandibular, um local anatômico caracterizado por acesso mínimo. Até onde sabemos, descrevemos pela primeira vez um protocolo menos invasivo de fratura mandibular não estabilizada em camundongos. Camundongos adultos são anestesiados com isoflurano e recebem uma dose pré-operatória de buprenorfina por injeção subcutânea. É realizada uma abordagem submandibular, com uma incisão na pele feita ao longo da borda inferior da mandíbula. O músculo masseter é elevado em um plano subperiosteal ao longo do ramo mandibular com um elevador periosteal. Uma fratura vertical e completa do ramo é realizada da borda basilar até a incisura coronoide (entre os processos condilar e coronóide), usando um dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica sob irrigação com soro fisiológico na borda basilar e tesoura para completar a fratura do ramo mandibular. A abordagem da pele é fechada por suturas de seda. Este procedimento detalhado para fraturas mandibulares não estabilizadas oferece um procedimento eficiente que permite perda óssea mínima e danos aos tecidos moles. Essa técnica garante resultados bem-sucedidos e consistentes para refletir com precisão o processo de reparo ósseo endocondral em modelos de camundongos.

Introdução

O reparo ósseo implica processos de ossificação membranosa e endocondral, dependendo da fratura ou da estabilização da osteotomia. O reparo ósseo após osteotomias ou fraturas ósseas estabilizadas depende da ossificação membranosa, enquanto as fraturas não estabilizadas ou osteotomias mal estabilizadas se consolidam de acordo com um modo de ossificação endocondral¹. O reparo ósseo membranoso é caracterizado pela formação óssea por diferenciação direta das células mesenquimais em osteoblastos, enquanto o reparo ósseo endocondral envolve a formação de um molde cartilaginoso transitório, que se diferencia em osteoblastos para formar o calo ósseo².

O reparo ósseo depende de múltiplas interações teciduais e celulares; também é influenciado por fatores específicos do local e pela força exercida sobre o calo³. O osso mandibular é um osso móvel que suporta forças mastigatórias, formado principalmente por osso cortical. O processo de reparo do osso mandibular é influenciado pelo local e pela direção da fratura. Sabe-se que lesões musculares e periósteas podem afetar a consolidação óssea, bem como perdas ósseas importantes no local da fratura ^4,5,6.

A análise do reparo ósseo endocondral mandibular implica protocolos padronizados e reprodutíveis para comparações valiosas e não tendenciosas. Em relação à literatura, poucos autores relatam protocolos para fraturas mandibulares não estabilizadas em modelos de camundongos ^3,7 e, em sua maioria, com direção anterior ao nível molar⁸. Ao desenvolver esta técnica, pretendemos evitar lesões musculares e periósteas e limitar a perda óssea no local da fratura para melhor analisar o processo de reparo ósseo endocondral sem fatores de confusão. Além disso, o objetivo de desenvolver uma nova técnica para fratura mandibular em camundongos foi minimizar a dor pós-operatória e a morte de animais freqüentes em tais cirurgias em pequenos animais. Pela primeira vez, descrevemos um protocolo menos invasivo para fratura mandibular não estabilizada no nível do ramo em camundongos. Este protocolo in vivo evita danos musculares e periósteos excessivos ou perda óssea no local da fratura e ajuda a reduzir o nível de dor pós-operatória e o risco de morte do animal.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Imagine Institute e foi validado por comitês de ética e pelo ministério francês (APAFIS 26995).

1. Animais

1. Determine o número de animais por grupo. Recomendamos 12 animais por grupo. Determine o sexo e a idade dos camundongos. Este protocolo é adaptado para camundongos C57BL/6J de 6 semanas de idade (machos ou fêmeas).
2. Dê aos animais, pelo menos 1 semana antes do procedimento, gel de suplemento nutricional para aclimatação.

2. Procedimento cirúrgico

1. Prepare o material necessário. Autoclave os instrumentos: tesoura, chave de agulha, fórceps, inserto e peça de mão do dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica e elevador. Prepare luvas estéreis, suturas de seda (4/0), barbeador, gaze de algodão, solução de iodopovidona a 10%, mesa de aquecimento, isoflurano e máscara de focinho para inalação de isoflurano.
2. Prepare a buprenorfina a 0,1 mg/kg, diluída em soro fisiológico injetável estéril. Administre buprenorfina por injeção subcutânea com agulha 25G 30 min antes da cirurgia.
3. Prepare a placa de aquecimento (37 °C), coloque um suporte de espuma sobre ela e fixe a máscara do focinho com pequenas agulhas ou fita adesiva.
4. Colocar o camundongo no tanque de isoflurano para indução, com difusão de isoflurano (4%). Teste a profundidade da anestesia realizando uma pinça do dedo do pé. Em caso de indução suficiente, será observada uma falta de reflexo podal.
5. Coloque o camundongo anestesiado de costas na placa de aquecimento coberta por um campo estéril mantido a 37 °C durante todo o procedimento. Posicione a máscara no focinho para inalação contínua de isoflurano (manutenção a 2,5%). Fixe as extremidades do mouse com fita adesiva.
6. Aplique lubrificante ocular bilateralmente para evitar o ressecamento ocular induzido pela anestesia geral. Raspe os pelos submandibulares, use luvas estéreis e desinfete a pele com vários toques de solução de iodopovidona a 10% e álcool.
7. Realize a abordagem cutânea submandibular conforme descrito abaixo.
   1. Faça uma incisão na pele do ângulo mandibular até a junção 1/3 posterior - 2/3 anterior do ramo horizontal da mandíbula com microtesoura.
   2. Disseque os tecidos subcutâneos para expor o músculo masseter.
8. Desinsira o músculo masseter com o uso de um elevador periosteal da borda inferior da mandíbula.
9. Eleve o músculo masseter em um plano subperiosteal ao longo do ramo mandibular com o elevador.
10. Crie uma pequena osteotomia (3 mm de comprimento) na borda inferior da mandíbula usando o dispositivo de cirurgia óssea piezoelétrica sob irrigação com soro fisiológico (máximo de 10 mL/min) na borda inferior da mandíbula, anteriormente ao ângulo mandibular, na parte posterior da concavidade (Figura 1, Figura 2).
11. Localize a borda posterior da mandíbula e a incisura coronoide (com a microtesoura ou a pinça) e complete a fratura com o uso de pequenas tesouras retas inseridas ao longo do ramo mandibular para evitar abertura adicional do músculo masseter e lesão. Para permitir a orientação correta da fratura, coloque a tesoura perpendicularmente à borda inferior da mandíbula.
12. Verifique se a fratura está totalmente completa: a mobilidade total entre os dois segmentos ósseos deve ser observada durante a mobilização suave dos 2 segmentos com fórceps.
13. Feche a abordagem da pele com suturas de seda (4/0) com suturas separadas. Nenhuma sutura é necessária no periósteo.
    NOTA: Alternativamente, a abordagem da pele pode ser suturada com outras suturas não absorvíveis (por exemplo, suturas de polipropileno).
14. Realize radiografias laterais cefálicas para confirmar a direção da fratura (Figura 3).
    1. Coloque o mouse novamente no tanque de isoflurano para uma breve reindução antes de realizar os raios-X. Em seguida, coloque o mouse em extensão, na lateral
    2. Em caso de fratura colocada muito anteriormente ao nível de um molar inferior ou quando a fratura descolou o ângulo mandibular (Figura 4), observe um aumento anormal no volume do calo ósseo. Nesses casos, exclua os animais do estudo para evitar qualquer viés na análise.
15. Verifique os ratos até que eles recuperem a consciência antes de colocá-los de volta na gaiola.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Prepare uma gaiola de rato sem ração e enriquecimento duro para evitar quaisquer forças mastigatórias.
2. Isole o camundongo operado em uma única gaiola pela^1ª semana até que a pele esteja completamente curada. Com 1 semana de pós-operatório, o grupo operou camundongos fêmeas juntos na mesma gaiola.
3. Administre buprenorfina (0,1 mg / kg) por injeções subcutâneas em 4 h, 24 h, 48 h e 72 h após o procedimento.
4. Alimente os camundongos com gel de dieta macia durante todos os períodos pós-operatórios, desde o dia 0 até o final do período de consolidação (ou seja, 28 dias) para evitar dor e deslocamento secundário da fratura.
5. Pesar diariamente os camundongos do dia 0 ao dia 4 após a fratura, pela manhã, antes da injeção de buprenorfina e depois 3x por semana até o sacrifício do animal (14 dias após a fratura).
6. Avalie o bem-estar animal pós-operatório para otimizar os cuidados pós-operatórios com os animais. Utilizar a escala de pontuação da Tabela 1 para avaliar o estado pós-operatório do animal e adaptar o seguimento. Quando o escore é > 1, é administrada injeção de buprenorfina, e quando o escore é > 3 e/ou em caso de perda de peso > 20% do peso pré-operatório apesar do enriquecimento alimentar, a eutanásia deve ser discutida (Tabela 1).

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Resultados

Quanto aos procedimentos cirúrgicos in vivo , para realizar de forma otimizada este procedimento de fratura mandibular não estabilizada em um modelo de camundongo, são necessários aprendizado e treinamento específicos.

Esta técnica de fratura mandibular não estabilizada permite o estudo do processo de reparo ósseo endocondral. Após a eutanásia, amostras mandibulares foram coletadas em paraformaldeído a 4% (24 h). Após descalcificação tot...

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Discussão

A técnica permite a realização de fraturas mandibulares não estabilizadas em um modelo de camundongo dentro de uma abordagem aberta mínima em um curto tempo de procedimento (cerca de 10 min ou menos). Este procedimento de curta duração limita o risco de morbidade e morte animal, especialmente em pequenos animais, como camundongos. Para obter resultados comparáveis na análise do processo de reparo ósseo endocondral, deve-se tomar cuidado especial para realizar as fraturas mandib...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine : Buprecare 0.3 mg/kg	Animalcare
Elevator OBWEGESER width 6mm Length 17,5cm	Collin Medical	HA 5905
Forceps : Pad Plate MORIA 11 cm N°5	MORIA	9906
Heating table Bioseblab 55 cm x 33 cm	Bioseblab	707
Needle HOLDER : Micro Halsey Needle Holder - Metal	LABODERM	21,100
Neo Clear	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	109843
Ocry Gel Tube 10 g (eye lubricant)	tvm lab	3.70045E+12
Piezotome 2 ASS FINAL	ACTEON	X57402
Piezotome insert Piezocision PZ3	ACTEON	F87574
Scissors micro	MORIA	MC52
Silk sutures PERMA HAND SEIDE  / MERSILK	ETHICON	REF 18501G
Straight scissors	MORIA	4877A
Vetflurane (isoflurane) 250 ml	VIRBAC	VET066 (Centravet)