动物行为评估与卷积神经网络相结合研究芥末-酒精味-嗅相互作用

摘要

本文介绍了一组测量嗅探酒精饮料对芥末引起的刺痛感的抑制能力的方法。

摘要

通常用于食品制备的商业芥末酱含有化学感应异硫氰酸酯 （ITC） 的同源化合物，食用后会引起刺激感。从未研究过闻膳食酒精饮料对芥末辣味的影响。虽然大多数感官评估研究分别关注个别食品和饮料，但缺乏关于在食用芥末时闻酒的嗅觉研究的研究。在这里，开发了一种方法，该方法结合了动物行为研究和卷积神经网络的使用，以分析小鼠在同时闻酒和食用芥末时的面部表情。结果表明，经过训练和验证的深度学习模型识别了 29% 的图像，这些图像描绘了属于芥末阴性酒类阳性组的芥末和酒精的共处理，而无需事先进行训练材料过滤。对从所选视频帧图像中获得的小鼠鬼脸量表评分的统计分析显示，有酒和无酒之间存在显着差异 （P < 0.01）。这一发现表明，膳食酒精饮料可能对小鼠芥末引发的反应的影响减弱。这种组合方法在未来具有用于单个 ITC 化合物筛选和烈酒成分感官分析的潜力。然而，需要进一步的研究来探讨酒精诱导抑制芥末辛辣味的潜在机制。

引言

Wasabia japonica，俗称 wasabi，在食品制备方面已获得认可 ^1,2。它在食用时会引发强烈的感官体验，其特征是流泪、打喷嚏或咳嗽，这是众所周知的。芥末的这种独特的辛辣味可归因于化学感应异硫氰酸酯 （ITC） 的同源化合物。它们是挥发性有机硫植物化学物质，可分为 ω-烯基和 ω-甲基硫代烷基异硫氰酸酯³。在这些化合物中，异硫氰酸烯丙酯 （AITC） 是十字花科植物（如辣根和芥末⁴）中发现的最主要的天然 ITC 产物。商业芥末酱通常由辣根制成，这使得 AITC 成为用于这些商业产品质量控制的化学标志物⁵。

将膳食酒精饮料与芥末菜肴搭配可以被认为是文化性格的一个例子⁶.主观上，这种组合可能会补充芥末和烈酒之间的辣味和热量，从而增强整体烹饪体验。动物定性行为评估 （QBA） 是一种全面的全动物方法，它使用数字术语⁷ 检查受试者对短期或长期外部刺激的反应行为变化。该方法包括疼痛测试、运动测试、学习和记忆测试，以及专为啮齿动物模型设计的情绪测试⁸。然而，直到现在，调查味觉与嗅觉的协同感官评估的研究在文献中仍然很少 ^9,10。大多数关于化学感觉的研究仅限于分别检查个人食物和饮料的消费¹¹。因此，缺乏关于味觉-嗅觉相互作用的研究，涉及在食用芥末时闻酒的行为。

由于芥末诱导的刺痛感被认为是伤害感受的一种形式¹²，因此动物行为评估非常适合评估啮齿动物的伤害感受反应 ^8,13,14。Langford 等人开发了一种评估小鼠伤害感受的方法，称为小鼠鬼脸量表 （MGS） 评分^15,16。这种行为研究方法是一种与疼痛相关的评估方法，依赖于对实验小鼠表现出的面部表情的分析。实验设置很简单，包括一个透明笼子和 2 个用于视频录制的摄像头。通过结合先进技术 17,18,19 进行自动数据捕获，可以获得定量和定性的行为测量，从而提高行为监测期间的动物福利 ²⁰。因此，MGS 有可能以不间断和随意的方式应用于研究各种外部刺激对动物的影响。但是，评分过程仅涉及选择少量（少于 10 个）视频帧图像供小组成员评估，并且需要事先进行培训。对大量样本图像进行评分可能是一项劳动密集型工作。为了克服这个耗时的挑战，一些研究采用了机器学习技术来预测 MGS 评分^21,22。然而，重要的是要注意 MGS 是一项持续的衡量标准。因此，多类分类模型更适合评估逻辑和分类问题，例如确定小鼠同时摄入芥末和嗅酒的图像是否与正常小鼠的图像相似。

在这项研究中，提出了一种研究小鼠味觉-嗅觉相互作用的方法。该方法将动物行为研究与卷积神经网络 （CNN） 相结合，以分析小鼠受试者的面部表情。在正常行为条件下，在芥末诱导的伤害感受期间以及在专门设计的笼子中嗅酒时，对两只小鼠进行了三次观察。对小鼠的面部表情进行视频记录，并利用生成的帧图像来优化深度学习 （DL） 模型的架构。然后使用独立的图像数据集对模型进行验证，并部署以对从实验组获取的图像进行分类。为了确定小鼠在食用芥末期间同时闻酒时芥末刺激性抑制的程度，人工智能提供的见解通过与另一种数据分析方法（MGS 评分¹⁶）的交叉验证进一步证实。

研究方案

在本研究中，两只体重在 17-25 g 之间的 7 周龄 ICR 雄性小鼠用于动物行为评估。所有房屋和实验程序均已获得香港浸会大学关于在教学和研究中使用人类和动物受试者的委员会的批准。在 12 小时的明暗循环中，动物室保持在 25 °C 的温度和 40%-70% 的室内湿度。

1. 保持架设计

1. 准备 3 种不同尺寸的丁苯乙烯砖用于笼式结构:8 mm x 8 mm x 2 mm、16 mm x 16 mm x 6 mm 和 32 mm x 16 mm x 6 mm。
2. 准备一个丙烯腈丁二烯苯乙烯板 （312 mm x 147 mm x 2 mm） 作为笼式底座。
3. 准备一块 239 毫米 x 107 毫米、厚度为 2 毫米的非透明亚克力板作为底板。
4. 准备一块 239 毫米 x 107 毫米、厚度为 5 毫米的透明亚克力板作为顶板。
5. 准备一块 107 mm x 50 mm 的厚度为 7 mm 的透明亚克力板作为接线板。
6. 通过将积木堆叠到 54 毫米的高度来构建 2 个不透明的侧墙。
7. 将丙烯酸板嵌入丙烯腈丁二烯苯乙烯基笼中，如图 1A 所示。
8. 准备一个由五个 90 毫米 x 50 毫米的透明丙烯酸板构成的 chows' 室，厚度为 2 毫米，如图 1B 所示。在 5 个透明亚克力板中，侧面使用 2 个板，顶部 1 个板，底部 1 个板，端子 1 个板。
9. 准备一个 60 毫米 x 50 毫米 2 毫米的透明亚克力板作为食物介绍板，并将其放入食物室中。

2. 动物行为评估

1. 将 2 只 7 周龄 ICR 雄性小鼠的同窝小鼠一起放在一个普通笼子里。
2. 为 2 只小鼠的同窝小鼠提供为期 1 周的适应期，免费获得食物颗粒和自来水。
3. 1 周后，用一瓶乙醇 （~40% v/v） 引入 2 只小鼠的同窝小鼠。
   注意:确保他们只被允许在限制饮酒的情况下 随意 闻或吸入提供的乙醇水。
4. 使用 9-10 周龄的小鼠模型和 图 1A 中描述的透明隔间笼进行行为实验。
5. 拆卸所有亚克力板和丙烯腈丁二烯苯乙烯板并彻底清洁它们。首先用超纯水冲洗至少 3 次，然后用纸巾擦干。接下来，用 75% 乙醇喷洒它们，然后用镜头纸清洁它们。最后，让它们风干至少 15 分钟。
6. 在每次重复行为实验之前，称量小鼠并记录它们的体重。
7. 称量 1 克市售芥末和 4.5 克花生酱，新鲜制备芥末和花生酱的混合物。将它们混合在一个拉链塑料袋中。
   注意:由于芥末中异硫氰酸盐的挥发性，将市售芥末储存在 -20 °C 冰箱中非常重要。
8. 称重并在食物介绍板上提供两种 0.5 克花生酱糊或芥末和花生酱的混合物，如图 1B、C 所示。
9. 如图 1B、C 所示，将准备好的食物介绍板放在 chows' 室中，以允许 2 只小鼠在每次视频录制期间 随意 获取食物。
10. 用 30 mL 液体填充下面的凹槽，纯水或白酒（~42% v/v 乙醇），以促进同时吸入，如图 1B、C 所示。
11. 使用放置在每个终端的手机支架上的 2 部智能手机上的相机开始录制。
    注:视频规格如下:帧宽，1920;框架高度，1080;数据速率，20745 kbps;帧速率，每秒 30.00 帧 （fps）。
12. 小心地将 2 只训练有素的同窝小鼠从顶部放入设计的动物行为研究平台中，并立即用顶板固定笼子。
    注意:请确保在 15 秒内完成此步骤。
13. 录制每个视频 2-3 分钟。
    注意:确保实验的整个持续时间，从准备花生酱-芥末混合物到完成视频录制，都限制在 5 分钟以内。
14. 重复整个实验 3 次。
    注意:确保实验的每个重复分离至少 6 小时。
15. 模拟不同的场景。
    注意:例如，在这项工作中，一对小鼠被分成 4 组，有 4 种不同的场景，通过使用上述实验设置来模拟。这些情景包括背景研究的情景 A、阳性对照研究的情景 B、芥末-酒精味-嗅相互作用研究的情景 C 和阴性对照研究的情景 D。 表 1 提供了这些场景的摘要。

3. 图像识别

与许多关于图像处理的研究 23,24,25 类似，分类模型是通过训练 CNN 获得的。DL 操作的脚本是在 Jupyter Notebook （anaconda3） 上用 Python v.3.10 编写的。它位于以下 GitHub 存储库中:git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。为了构建和训练 CNN，使用了开源库，包括 numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0 和 keras v.2.11.0。这些库提供了开发和训练用于图像识别的 CNN 所需的工具和功能。

1. 从收集的视频剪辑中导出一系列视频帧图像，以使用提供的名为 Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb 的 Jupyter Notebook 生成用于模型训练的数据集。
2. 仅选择至少有 1 只鼠标使用提供的粘贴的图像。所选图像的示例在 补充图 1、补充图 2、补充图 3、补充图 4、补充图 5、补充图 6 和 补充图 7 中提供。
3. 通过实施 Jupyter Notebook 中提供的名为 Step2_DataAugmentation.ipynb 的脚本，通过水平翻转生成的图像来执行数据增强。
4. 保留每秒复制的图像数据，用于外部独立的 CNN 模型验证。使用来自每个第一个和第三个重复的图像进行内部模型训练和测试。
5. 通过在 Jupyter Notebook 中运行名为 Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb 的脚本，对 CNN 建模中使用的图像数据进行预处理，包括图像大小调整、黑色转换和图像信号归一化。
6. 以 8:2 的方式随机将训练材料拆分为内部训练和测试数据集。
7. 初始化 CNN 的体系结构。根据要检查的场景数量设计 CNN 的输出数量。
   注意:例如，在本研究中，神经网络被指定对 3 个类别进行分类。确保编译了用于处理类权重数据不平衡的脚本。
8. 找到在 CNN 构建的内部测试样本上产生最小损失的超参数组合。
9. 采用最优超参数组合构建 CNN 架构。
10. 打开提供的 Jupyter Notebook Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb 和 Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb。使用来自动物行为实验的第二个复制品的独立（原始和翻转）图像验证获得的模型。
11. 部署获得和验证的模型，以使用 Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb 对实验组生成的视频帧图像进行分类。
    注意:例如，这是本作品中的场景 C。

4. 手动鼠标鬼脸量表评分

注:为了验证 CNN 模型预测提供的见解，应用了 Langford 等人先前开发和验证的另一种方法¹⁶。该方法涉及根据 5 个特定的小鼠面部动作单位 （AU） 对 MGS 进行评分:眼眶收紧、鼻子隆起、脸颊隆起、耳朵向外收紧和胡须变化。每个 AU 都分配了 0 、 1 或 2 的分数，分别表示 AU 的缺失、中度存在或明显存在。该评分系统允许对每个 AU 进行量化和缩放，以评估小鼠所经历的伤害感受或不适程度。

1. 捕获同窝动物为每个视频剪辑摄取糊状物的 3 个视频帧图像。确保每帧之间至少相隔 3 秒。
2. 通过使用提供的名为 "shuffleSlides.pptm" 的模板文件（补充文件 1）并运行嵌入的宏代码，按顺序对来自不同类别的场景的图像进行盲代码和随机重新排序。
3. 邀请至少 10 位答疑者对示例图像进行评分。
4. 培训专家使用 MGS 对图像样本进行评分。向小组成员提供培训材料，其中包括有关 MGS 的原始文章及其手册^15,16。
5. 通过对对应 5 个面部 AU 的所有得分点求平均值，计算捕获帧中每个动物受试者的 MGS 分数。将 MGS 分数表示为测量误差 （SEM） 的平均值±标准误差。
6. 通过使用 Bonferroni 的多重比较事后检验的单因素方差分析 （ANOVA） 来确定不同类别的场景之间是否存在统计显著差异。
   注: P < 0.05 的值被认为具有统计显著性。

结果

本研究的主要目的是建立一个强大的框架来研究小鼠的味觉-嗅觉相互作用。该框架结合了人工智能和 QBA 的使用来开发预测分类模型。此外，从 DL 获得的见解与定量 MGS 评估进行交叉验证，以进行内部独立分析。该方法的主要应用是检查小鼠嗅闻膳食酒精饮料时对芥末引发的伤害感受的抑制程度。

深度学习模型识别了 29% 的芥末-酒精共处理图像，这些图像属于芥末阴性...

讨论

本研究中提出的研究味觉-嗅觉相互作用的方法基于由 Langford 等人开发的小鼠面部疼痛表情的原始行为编码方法¹⁶。最近发表的几篇文章介绍了 CNN 用于自动鼠标面部跟踪和随后的 MGS 评分 21,26,27,28。与单独的原始方法相比，应用 CNN 具有优势，因为它可以生成一系列可用于训练预测模...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU