שילוב של הערכה התנהגותית של בעלי חיים ורשת עצבית קונבולוציונית לחקר אינטראקציה בין טעם וריח לאלכוהול ווסאבי

Summary

מאמר זה מתאר סדרה של שיטות למדידת יכולת הדיכוי של רחרוח משקאות אלכוהוליים על תחושת הצריבה המעוררת ווסאבי.

Abstract

משחות הווסאבי המסחריות המשמשות בדרך כלל להכנת מזון מכילות תרכובת הומולוגית של איזותיוציאנטים כימו-סנסוריים (ITC) המעוררים תחושה מגרה בעת צריכתם. ההשפעה של רחרוח משקאות אלכוהוליים דיאטטיים על תחושת חריפות הווסאבי מעולם לא נחקרה. בעוד שרוב מחקרי ההערכה החושית מתמקדים במזון ומשקאות בודדים בנפרד, חסרים מחקרים על מחקר חוש הריח של רחרוח משקאות חריפים בזמן צריכת ווסאבי. כאן פותחה מתודולוגיה המשלבת שימוש במחקר התנהגותי של בעלי חיים ורשת עצבית קונבולוציונית לניתוח הבעות הפנים של עכברים כאשר הם מרחרחים בו זמנית משקאות חריפים וצורכים ווסאבי. התוצאות מראות כי מודל הלמידה העמוקה המיומן והמתוקף מזהה 29% מהתמונות המתארות טיפול משותף בווסאבי ובאלכוהול השייכים לקבוצת הוואסבי-שלילי למשקאות חריפים-חיוביים ללא צורך בסינון חומרי הדרכה מקדים. ניתוח סטטיסטי של ציוני סולם עווית עכברים המתקבלים מתמונות מסגרת הווידאו שנבחרו מגלה הבדל משמעותי (P < 0.01) בין נוכחות והיעדר משקאות חריפים. ממצא זה מצביע על כך שלמשקאות אלכוהוליים תזונתיים עשויה להיות השפעה פוחתת על תגובות הוואסבי בעכברים. מתודולוגיה קומבינטורית זו טומנת בחובה פוטנציאל לסינון תרכובת ITC פרטנית ולניתוחים חושיים של מרכיבי הרוח בעתיד. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של דיכוי אלכוהול של חריפות ווסאבי.

Introduction

Wasabia japonica, הידוע בכינויו ווסאבי, זכה להכרה בהכנת מזון ^1,2. החוויה החושית האינטנסיבית שהיא מעוררת בעת הצריכה, המאופיינת בדמעות, התעטשויות או שיעול, ידועה היטב. ניתן לייחס את החריפות הייחודית הזו של ווסאבי לתרכובת הומולוגית של איזותיוציאנטים כימו-סנסוריים (ITC). הם פיטוכימיקלים נדיפים של אורגנו-גופרית שניתן לסווג ל-ω-alkenyl ו-ω-methylthioalkyl isothiocyanates³. מבין תרכובות אלה, אליל איזותיוציאנט (AITC) הוא מוצר ITC הטבעי הנפוץ ביותר שנמצא בצמחים השייכים למשפחת המצליבים, כגון חזרת וחרדל⁴. משחות ווסאבי מסחריות מוכנות בדרך כלל מחזרת, מה שהופך את AITC לסמן כימי המשמש לבקרת איכות של מוצרים מסחריים אלה⁵.

שילוב משקאות אלכוהוליים דיאטטיים עם מנות עם ווסאבי יכול להיחשב דוגמה לנטייה תרבותית⁶. מבחינה סובייקטיבית, שילוב זה עשוי להשלים את החריפות והחום שבין הוואסבי לרוח, ולהעצים את החוויה הקולינרית הכוללת. הערכה התנהגותית איכותנית של בעלי חיים (QBA) היא גישה מתודולוגית מקיפה של בעלי חיים שלמים הבוחנת שינויים התנהגותיים בנבדקים בתגובה לגירויים חיצוניים קצרי טווח או ארוכי טווח באמצעות מונחים מספריים⁷. שיטה זו כוללת מבחני כאב, מבחנים מוטוריים, מבחני למידה וזיכרון, וכן מבחני רגש שתוכננו במיוחד עבור דגמי מכרסמים⁸. עם זאת, מחקרים שבדקו את ההערכה החושית הסינרגטית של חוש הריח יחד עם חוש הריח נותרו נדירים בספרות עד כה ^9,10. רוב המחקרים על תחושה כימיתטית מוגבלים לבחינת צריכת מזון ומשקאות בודדים^{בנפרד 11}. כתוצאה מכך, קיים מחסור במחקר על האינטראקציה טעם-ריח הכרוכה בפעולת הרחרוח של משקאות חריפים בזמן צריכת ווסאבי.

מכיוון שתחושת הצריבה הנגרמת על ידי ווסאבי נחשבת לצורה של nociception¹², הערכות התנהגותיות של בעלי חיים מתאימות היטב להערכת התגובות החושיות הנוסיספטיביות בחיות מכרסמים ^8,13,14. שיטה להערכת nociception בעכברים, הידועה בשם ניקוד סולם עווית עכבר (MGS) פותחה על ידי Langford et ^al.15,16. שיטת מחקר התנהגותית זו היא גישת הערכה הקשורה לכאב, המסתמכת על ניתוח הבעות הפנים המוצגות על ידי עכברי הניסוי. מערך הניסוי פשוט, וכולל כלוב שקוף ו-2 מצלמות להקלטת וידאו. על ידי שילוב טכנולוגיות מתקדמות 17,18,19 ללכידת נתונים אוטומטית, ניתן להשיג מדדים התנהגותיים כמותיים ואיכותיים, המשפרים את רווחת בעלי החיים במהלך ניטור התנהגותי ²⁰. כתוצאה מכך, ל- MGS יש פוטנציאל להיות מיושם בחקר ההשפעות של גירויים חיצוניים שונים על בעלי חיים באופן רצוף ואד ליביטום. עם זאת, תהליך הניקוד כולל רק כמה (פחות מ -10) תמונות מסגרת וידאו להערכה על ידי חברי הפאנל, ויש צורך בהכשרה מוקדמת. ניקוד מספר רב של תמונות לדוגמה יכול להיות עבודה רבה. כדי להתגבר על אתגר גוזל זמן זה, מספר מחקרים השתמשו בטכניקות למידת מכונה לחיזוי ציון MGS^21,22. עם זאת, חשוב לציין כי MGS הוא מדד מתמשך. לכן, מודל סיווג רב-מעמדי יתאים יותר להערכת בעיה לוגית וקטגורית, כגון קביעה אם התמונות של עכברים בולעים ווסאבי ומרחרחים בו זמנית דומים לאלה של עכברים רגילים.

במחקר זה הוצעה מתודולוגיה לחקר האינטראקציה בין טעם לריח בעכברים. מתודולוגיה זו משלבת מחקרים התנהגותיים בבעלי חיים עם רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) כדי לנתח את הבעות הפנים של נבדקי העכבר. שני עכברים נצפו שלוש פעמים בתנאי התנהגות רגילים, במהלך החוויה של נוסיספטציה הנגרמת על ידי ווסאבי ובזמן שרחרח משקאות חריפים בכלוב שתוכנן במיוחד. הבעות הפנים של העכברים הוקלטו בווידיאו, ותמונות המסגרת שנוצרו שימשו לאופטימיזציה של הארכיטקטורה של מודל למידה עמוקה (DL). לאחר מכן המודל אומת באמצעות מערך נתונים עצמאי של תמונות ונפרס כדי לסווג את התמונות שנרכשו מקבוצת הניסוי. כדי לקבוע את מידת דיכוי חריפות הוואסבי כאשר העכברים רחרחו בו זמנית משקאות חריפים במהלך צריכת הווסאבי, התובנות שסופקו על ידי בינה מלאכותית אוששו עוד יותר באמצעות אימות צולב עם שיטת ניתוח נתונים אחרת, ה- MGS קיבל ציון¹⁶.

Protocol

במחקר זה, שני עכברי ICR זכרים בני 7 שבועות במשקל של בין 17-25 גרם שימשו להערכה התנהגותית של בעלי חיים. כל הליכי הדיור והניסויים אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה הבפטיסטית של הונג קונג לשימוש בבני אדם ובבעלי חיים בהוראה ובמחקר. חדר החיות נשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות בחדר של 40%-70% במחזור אור-חושך של 12 שעות.

1. עיצוב כלוב

1. הכינו לבני סטירן אקרילוניטריל בוטאדיאן ב-3 מידות שונות לבניית כלובים: 8 מ"מ x 8 מ"מ x 2 מ"מ, 16 מ"מ x 16 מ"מ x 6 מ"מ, ו- 32 מ"מ x 16 מ"מ x 6 מ"מ.
2. הכינו צלחת סטירן אקרילוניטריל בוטאדיאן (312 מ"מ x 147 מ"מ x 2 מ"מ) כבסיס הכלוב.
3. הכינו צלחת אקרילית לא שקופה בגודל 239 מ"מ x 107 מ"מ בעובי של 2 מ"מ שתשמש כצלחת התחתונה.
4. הכינו צלחת אקרילית שקופה בגודל 239 מ"מ x 107 מ"מ בעובי של 5 מ"מ שתשמש כצלחת העליונה.
5. הכינו לוח אקרילי שקוף בגודל 107 מ"מ x 50 מ"מ בעובי של 7 מ"מ שישמש כלוח הדקים.
6. בניית 2 קירות צד אטומים על ידי ערימת לבנים לגובה של 54 מ"מ.
7. הטמיעו את לוחות האקריליק בכלוב מבוסס אקרילוניטריל בוטאדיאן על בסיס סטירן, כפי שמודגם באיור 1A.
8. הכינו תא צ'וס שנבנה מחמישה לוחות אקריליק שקופים בגודל 90X50 מ"מ בעובי של 2 מ"מ, כפי שמודגם באיור 1B. בין 5 לוחות אקריליק שקופים, להשתמש 2 צלחות עבור הצדדים, צלחת אחת עבור העליון, צלחת אחת עבור התחתון, ו 1 צלחת עבור הטרמינל.
9. הכינו צלחת אקריליק שקופה בגודל 60 מ"מ על 50 מ"מ בקוטר 2 מ"מ כצלחת מבוא לצ'או, והניחו אותה בתא הצ'או.

2. הערכה התנהגותית של בעלי חיים

1. המלטות בית של 2 עכברי ICR זכרים בני 7 שבועות יחד בכלוב רגיל.
2. ספקו להמלטות של 2 עכברים גישה חופשית לכדורי מזון ומי ברז לתקופת הסתגלות של שבוע.
3. לאחר שבוע, להציג את littermates של 2 עכברים עם בקבוק אתנול (~ 40% v/v).
   הערה: ודא שהם מורשים רק לרחרח או לשאוף את האתנול המימי שסופק על בסיס אד ליביטום , בזמן שהשתייה מוגבלת.
4. ערכו ניסויים התנהגותיים באמצעות מודל העכבר בן 9-10 השבועות וכלוב התא השקוף שמתואר באיור 1A.
5. יש לפרק את כל לוחות האקריליק וצלחות הסטירן אקרילוניטריל בוטאדיאן ולנקות אותם היטב. התחל על ידי שטיפתם עם מים טהורים במיוחד לפחות 3 פעמים ולאחר מכן יבש אותם באמצעות מגבות נייר. לאחר מכן, רססו אותם עם 75% אתנול, ולאחר מכן נקו אותם עם נייר עדשה. לבסוף, הניחו להם להתייבש באוויר למשך 15 דקות לפחות.
6. שקלו את העכברים ורשמו את משקל גופם לפני כל שכפול של הניסוי ההתנהגותי.
7. מכינים תערובת טרייה של ווסאבי וחמאת בוטנים במשקל 1 גרם ווסאבי מסחרי ו-4.5 גרם חמאת בוטנים. מערבבים אותם בשקית ניילון עם רוכסן.
   הערה: בשל התנודתיות של האיזותיוציאנטים בוואסאבי, חשוב לאחסן את הווסאבי המסחרי במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
8. שקלו וספקו שתי משחות של 0.5 גרם חמאת בוטנים או תערובת של ווסאבי וחמאת בוטנים על צלחת המבוא לצ'או, כפי שמודגם באיור 1B, C.
9. הניחו את צלחת הכנסת הצ'או המוכנה בתא הצ'או, כפי שמודגם באיור 1B, C, כדי לאפשר לשני העכברים גישה למזון במהלך כל הקלטת וידאו.
10. מלאו את החריץ שמתחתיו ב-30 מ"ל של נוזל, מים טהורים או משקאות חריפים (~42% אתנול v/v), כדי להקל על שאיפה בו-זמנית, כפי שמצוין באיור 1B, C.
11. התחל להקליט באמצעות המצלמות על 2 טלפונים חכמים להציב על עמדות הטלפון בכל מסוף.
    הערה: מפרטי הסרטונים הם כדלקמן: רוחב מסגרת, 1920; גובה מסגרת, 1080; קצב נתונים, 20745 kbps; קצב פריימים, 30.00 מסגרות לשנייה (FPS).
12. הניחו בזהירות את 2 העכברים המאומנים בפלטפורמת המחקר ההתנהגותית המעוצבת של בעלי חיים מלמעלה ואבטחו מיד את הכלוב עם הצלחת העליונה.
    הערה: ודא ששלב זה הושלם תוך 15 שניות.
13. הקלט כל סרטון במשך 2-3 דקות.
    הערה: יש לוודא שכל משך הניסוי, מהכנת תערובת חמאת בוטנים-ווסאבי ועד להשלמת הקלטת הווידאו, מוגבל ל-5 דקות.
14. חזור על כל הניסוי 3 פעמים.
    הערה: ודא שכל העתק של הניסוי מופרד במשך 6 שעות לפחות.
15. חיקוי תרחישים שונים.
    הערה: לדוגמה, בעבודה זו, נעשה שימוש בזוג עכברים ב-4 קבוצות עם 4 תרחישים שונים שחיקו באמצעות הגדרת הניסוי שתוארה לעיל. תרחישים אלה כוללים תרחיש א' למחקר הרקע, תרחיש ב' למחקר הבקרה החיובית, תרחיש ג' למחקר האינטראקציה בין טעם וריח לאלכוהול ווסאבי, ותרחיש ד' למחקר הבקרה השלילית. טבלה 1 מספקת סיכום של תרחישים אלה.

3. זיהוי תמונה

בדומה למחקרים רבים על עיבוד תמונה 23,24,25, מודל סיווג הושג על ידי אימון CNN. הסקריפט לפעולות DL נכתב בפייתון v.3.10 על Jupyter Notebook (אנקונדה3). הוא זמין במאגר GitHub הבא: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. כדי לבנות ולאמן את CNN, נעשה שימוש בספריות קוד פתוח, כולל, numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 ו-keras v.2.11.0. ספריות אלה סיפקו את הכלים והפונקציונליות הדרושים כדי לפתח ולהכשיר את CNN לזיהוי תמונות.

1. יצא סדרה של תמונות מסגרת וידאו מסרטוני הווידאו שנאספו כדי ליצור ערכת נתונים לאימון מודלים באמצעות מחברת Jupyter שסופקה, בשם Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. בחר רק את התמונות עם עכבר אחד לפחות צורך את הדבק שסופק. דוגמאות לתמונות שנבחרו מופיעות באיור משלים 1, איור משלים 2, איור משלים 3, איור משלים 4, איור משלים 5, איור משלים 6 ואיור משלים 7.
3. בצע הגדלת נתונים על-ידי היפוך אופקי של התמונות שנוצרו על-ידי יישום הסקריפט שסופק במחברת Jupyter, בשם Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. שמור את נתוני התמונה מכל שכפול שנייה לצורך אימות חיצוני עצמאי של מודל CNN. השתמש בתמונות מכל עותק משוכפל ראשון ושלישי לצורך אימון ובדיקה פנימיים של הדגם.
5. עבד מראש את נתוני התמונה המשמשים במידול CNN על-ידי הפעלת הסקריפט במחברת Jupyter, בשם Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, כולל שינוי גודל תמונה, המרת צבע שחור ונורמליזציה של אותות תמונה.
6. פצלו את חומרי ההדרכה למערכי נתונים פנימיים של הדרכה ובדיקה באופן אקראי ביחס של 8:2.
7. אתחל את הארכיטקטורה עבור CNN. תכנן את מספר התפוקות של CNN בהתבסס על מספר התרחישים שיש לבחון.
   הערה: לדוגמה, במחקר זה, הרשת העצבית נועדה לסווג 3 כיתות. ודא שהסקריפט לטיפול בחוסר איזון נתונים במשקל הכיתה עבר הידור.
8. מצא את שילוב היפר-פרמטרים שמניב הפסד מינימלי בדגימות הבדיקה הפנימיות לבניית CNN.
9. אמץ את שילוב ההיפרפרמטרים האופטימלי לבניית ארכיטקטורת CNN.
10. פתח את Jupyter Notebooks שסופקו Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb ו- Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. לאמת את המודל שהושג באמצעות התמונות הבלתי תלויות (המקוריות וההפוכות) מההעתק השני של הניסוי ההתנהגותי בבעלי חיים.
11. פרוס את המודל שהושג ואומת לסיווג תמונות מסגרת הווידאו שנוצרו מקבוצת הניסוי באמצעות Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    הערה: לדוגמה, זהו תרחיש C בעבודה זו.

4. ניקוד סולם עווית עכבר ידני

הערה: כדי לאמת את התובנות שסופקו על ידי חיזוי מודל CNN, שיטה נוספת שפותחה ואומתה בעבר על ידי לנגפורד ואחרים יושמה¹⁶. שיטה זו כוללת ניקוד MGS בהתבסס על 5 יחידות פעולה ספציפיות לפנים של עכבר (AUs): הידוק מסלולי, בליטת אף, בליטת לחי, הידוק אוזניים כלפי חוץ ושינוי שפם. לכל AU מוקצה ציון של 0, 1 או 2, המציין את היעדר, נוכחות מתונה או נוכחות ברורה של AU, בהתאמה. מערכת ניקוד זו מאפשרת כימות וקנה מידה של כל AU כדי להעריך את רמת nociception או אי נוחות שחוו העכברים.

1. צלם 3 תמונות מסגרת וידאו של הליטרמטים בולעים את הדבק עבור כל סרטון וידאו. ודא שכל מסגרת מופרדת ב-3 שניות לפחות.
2. קוד עיוור וסידור מחדש אקראי של תמונות ממחלקות שונות של תרחישים ברצף באמצעות קובץ התבנית שסופק בשם "shuffleSlides.pptm" (קובץ משלים 1) והפעלת קוד המאקרו המוטבע.
3. הזמינו לפחות 10 חברי פאנל להבקיע את התמונות לדוגמה.
4. אמן את משתתפי הפאנל להבקיע דגימות תמונה באמצעות MGS. ספקו לחברי הפאנל חומרי הדרכה הכוללים את המאמר המקורי על MGS ואת המדריך^15,16.
5. חשב את ציון MGS של כל נבדק בעל חיים במסגרת שנלכדה על ידי ממוצע כל נקודות הניקוד של 5 AUs הפנים המתאימים. הצג את ציון MGS כממוצע ± שגיאת תקן של מדידה (SEM).
6. קבע אם קיימים הבדלים מובהקים סטטיסטית בין סוגים שונים של תרחישים על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן ההשוואה המרובים של Bonferroni לאחר הוק.
   הערה: ערך של P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

המטרה העיקרית של מחקר זה היא לבסס מסגרת איתנה לחקר האינטראקציה בין טעם לריח בעכברים. מסגרת זו משלבת שימוש בבינה מלאכותית ו- QBA לפיתוח מודל סיווג חזוי. בנוסף, התובנות המתקבלות מ- DL מאומתות עם הערכת MGS כמותית לצורך ניתוח פנימי בלתי תלוי. היישום העיקרי של מתודולוגיה זו הוא לבחון את מידת הדיכוי ש...

Discussion

השיטה המוצעת לחקר אינטראקציה בין טעם לריח בעבודה זו מבוססת על השיטה המקורית של קידוד התנהגותי להבעת פנים של כאב בעכברים, שפותחה על ידי Langford et ^al.16. מספר מאמרים שפורסמו לאחרונה הציגו את CNN למעקב אוטומטי אחר פני עכבר ולאחר מכן ניקוד MGS 21,26,27,28.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU