Integração da Avaliação Comportamental Animal e Rede Neural Convolucional para Estudar a Interação Sabor-Cheiro Wasabi-Álcool

Resumo

Este artigo descreve um conjunto de métodos para medir a capacidade supressora de cheirar bebidas alcoólicas na sensação de picada provocada por wasabi.

Resumo

As pastas comerciais de wasabi comumente usadas para preparação de alimentos contêm um composto homólogo de isotiocianatos quimiossensoriais (ITCs) que provocam uma sensação irritante após o consumo. O impacto de cheirar bebidas alcoólicas dietéticas na sensação de tempero do wasabi nunca foi estudado. Embora a maioria dos estudos de avaliação sensorial se concentre em alimentos e bebidas individuais separadamente, há uma falta de pesquisas sobre o estudo olfativo de cheirar licor durante o consumo de wasabi. Aqui, é desenvolvida uma metodologia que combina o uso de um estudo comportamental animal e uma rede neural convolucional para analisar as expressões faciais de camundongos quando eles cheiram licor e consomem wasabi simultaneamente. Os resultados demonstram que o modelo de deep learning treinado e validado reconhece 29% das imagens que retratam o co-tratamento de wasabi e álcool pertencentes à classe do grupo wasabi-negativo para licor positivo sem a necessidade de filtragem prévia de materiais de treinamento. A análise estatística dos escores da escala de caretas de camundongos obtidos a partir das imagens de quadros de vídeo selecionadas revela uma diferença significativa (P < 0,01) entre a presença e ausência de bebidas alcoólicas. Esse achado sugere que as bebidas alcoólicas dietéticas podem ter um efeito decrescente nas reações provocadas por wasabi em camundongos. Esta metodologia combinatória tem potencial para triagem individual de compostos ITC e análises sensoriais de componentes de espíritos no futuro. No entanto, mais estudos são necessários para investigar o mecanismo subjacente da supressão da pungência de wasabi induzida pelo álcool.

Introdução

Wasabia japonica, comumente conhecido como wasabi, ganhou reconhecimento no preparo de alimentos ^1,2. A intensa experiência sensorial que provoca no consumo, caracterizada por lacrimejar, espirrar ou tossir, é bem conhecida. Essa pungência distinta do wasabi pode ser atribuída a um composto homólogo de isotiocianatos quimiossensoriais (ITCs). Eles são fitoquímicos organossulfurados voláteis que podem ser categorizados em isotiocianatos de ω-alquenil e ω-metiltioalquil³. Dentre esses compostos, o isotiocianato de alila (AITC) é o produto natural ITC mais predominado em plantas pertencentes à família Cruciferae, como raiz-forte e mostarda⁴. As pastas comerciais de wasabi são comumente preparadas a partir de raiz-forte, tornando o AITC um marcador químico usado para controle de qualidade desses produtos comerciais⁵.

A combinação de bebidas alcoólicas dietéticas com pratos com infusão de wasabi pode ser considerada um exemplo de disposição cultural⁶. Subjetivamente, essa combinação pode complementar o tempero e o calor entre o wasabi e o destilado, aprimorando a experiência culinária geral. A avaliação comportamental qualitativa animal (QBA) é uma abordagem metodológica abrangente de animais inteiros que examina as mudanças comportamentais em indivíduos em resposta a estímulos externos de curto ou longo prazo usando termos numéricos⁷. Esse método engloba testes de dor, testes motores, testes de aprendizado e memória, além de testes de emoção projetados especificamente para modelos de roedores⁸. No entanto, estudos que investigam a avaliação sensorial sinérgica da gustação juntamente com o olfato permanecem escassos na literatura até o momento ^9,10. A maioria dos estudos sobre sensação quimestésica limita-se a examinar separadamente o consumo individual de alimentos e bebidas¹¹. Consequentemente, há uma escassez de pesquisas sobre a interação paladar-cheiro envolvendo o ato de cheirar licor enquanto consome wasabi.

Como se acredita que a sensação de picada induzida por wasabi seja uma forma de nocicepção¹², as avaliações comportamentais dos animais são adequadas para avaliar as respostas sensoriais nociceptivas em roedores ^8,13,14. Um método para avaliar a nocicepção em camundongos, conhecido como pontuação da escala de careta de camundongo (MGS), foi desenvolvido por Langford et ^al.15,16. Este método de estudo comportamental é uma abordagem de avaliação relacionada à dor, contando com a análise das expressões faciais exibidas pelos camundongos experimentais. A configuração experimental é simples, envolvendo uma gaiola transparente e 2 câmeras para gravação de vídeo. Ao incorporar tecnologias avançadas ^17,18,19 para captura automática de dados, medidas comportamentais quantitativas e qualitativas podem ser obtidas, aumentando o bem-estar animal durante o monitoramento comportamental²⁰. Consequentemente, o MGS tem potencial para ser aplicado no estudo dos efeitos de vários estímulos externos em animais de forma ininterrupta e ad libitum. No entanto, o processo de pontuação envolve apenas a seleção de algumas (menos de 10) imagens de quadros de vídeo para avaliação pelos painelistas, e é necessário treinamento prévio. Marcar um grande número de imagens de amostra pode ser trabalhoso. Para superar esse desafio demorado, vários estudos empregaram técnicas de aprendizado de máquina para prever o escore MGS ^21,22. No entanto, é importante notar que o MGS é uma medida contínua. Portanto, um modelo de classificação multiclasse seria mais adequado para avaliar um problema lógico e categórico, como determinar se as imagens de camundongos ingerindo wasabi e cheirando licor simultaneamente se assemelham às de camundongos normais.

Neste estudo, foi proposta uma metodologia para investigar a interação paladar-cheiro em camundongos. Essa metodologia combina estudos comportamentais de animais com uma rede neural convolucional (CNN) para analisar as expressões faciais dos camundongos. Dois camundongos foram observados três vezes em condições comportamentais normais, durante a experiência de nocicepção induzida por wasabi e enquanto cheiravam licor em uma gaiola especificamente projetada. As expressões faciais dos camundongos foram gravadas em vídeo e as imagens geradas foram utilizadas para otimizar a arquitetura de um modelo de aprendizado profundo (DL). O modelo foi então validado usando um conjunto de dados de imagens independentes e implantado para classificar as imagens adquiridas do grupo experimental. Para determinar a extensão da supressão da pungência do wasabi quando os camundongos cheiraram simultaneamente licor durante o consumo de wasabi, os insights fornecidos pela inteligência artificial foram corroborados por meio da validação cruzada com outro método de análise de dados, a pontuação MGS¹⁶.

Protocolo

Neste estudo, dois camundongos machos ICR de 7 semanas de idade pesando entre 17-25 g foram utilizados para a avaliação comportamental animal. Todos os procedimentos experimentais e de alojamento foram aprovados pelo Comitê da Universidade Batista de Hong Kong sobre o Uso de Seres Humanos e Animais no Ensino e Pesquisa. A sala dos animais foi mantida a uma temperatura de 25 °C e uma umidade ambiente de 40%-70% em um ciclo claro-escuro de 12 horas.

1. Projeto da gaiola

1. Prepare tijolos de acrilonitrila butadieno estireno em 3 dimensões diferentes para a construção de gaiolas: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm e 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Prepare uma placa de acrilonitrila butadieno estireno (312 mm x 147 mm x 2 mm) como base da gaiola.
3. Prepare uma placa de acrílico não transparente de 239 mm x 107 mm com uma espessura de 2 mm para ser usada como placa inferior.
4. Prepare uma placa de acrílico transparente de 239 mm x 107 mm com uma espessura de 5 mm para ser usada como placa superior.
5. Prepare uma placa de acrílico transparente de 107 mm x 50 mm com uma espessura de 7 mm para ser usada como placa terminal.
6. Construa 2 paredes laterais opacas empilhando tijolos a uma altura de 54 mm.
7. Incorpore as placas de acrílico na gaiola à base de acrilonitrila butadieno estireno, conforme ilustrado na Figura 1A.
8. Prepare uma câmara de ração construída por cinco placas de acrílico transparente de 90 mm x 50 mm com espessura de 2 mm, conforme ilustrado na Figura 1B. Entre as 5 placas de acrílico transparente, use 2 placas para as laterais, 1 placa para a parte superior, 1 placa para a parte inferior e 1 placa para o terminal.
9. Prepare uma placa de acrílico transparente de 60 mm x 50 mm e 2 mm como placa de introdução da ração e coloque-a na câmara da ração.

2. Avaliação comportamental animal

1. Irmãos de ninhada de 2 camundongos machos ICR de 7 semanas juntos em uma gaiola regular.
2. Forneça aos irmãos de ninhada de 2 ratos acesso gratuito a pellets de comida e água da torneira por um período de adaptação de 1 semana.
3. Após 1 semana, introduza os irmãos de ninhada de 2 camundongos com uma garrafa de etanol (~ 40% v / v).
   NOTA: Certifique-se de que eles só podem cheirar ou inalar o etanol aquoso fornecido ad libitum enquanto o consumo estiver restrito.
4. Realize experimentos comportamentais usando o modelo de camundongo de 9 a 10 semanas de idade e a gaiola de cubículo transparente representada na Figura 1A.
5. Desmonte todas as placas de acrílico e placas de acrilonitrila butadieno estireno e limpe-as bem. Comece enxaguando-os com água ultrapura pelo menos 3 vezes e depois seque-os com papel toalha. Em seguida, borrife-os com etanol a 75%, seguido de limpeza com papel para lentes. Por fim, deixe-os secar ao ar por pelo menos 15 min.
6. Pese os camundongos e registre seus pesos corporais antes de cada replicação do experimento comportamental.
7. Prepare na hora uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim pesando 1 g de wasabi comercial e 4,5 g de manteiga de amendoim. Misture-os em um saco plástico com zíper.
   NOTA: Devido à volatilidade dos isotiocianatos no wasabi, é importante armazenar o wasabi comercial em um freezer a -20 °C.
8. Pese e forneça duas pastas de 0,5 g de manteiga de amendoim ou uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim na placa de introdução da ração, conforme ilustrado na Figura 1B, C.
9. Coloque a placa de introdução de ração preparada na câmara das rações, conforme ilustrado na Figura 1B, C, para permitir que os 2 camundongos tenham acesso ad libitum aos alimentos durante cada sessão de gravação de vídeo.
10. Preencha a ranhura abaixo com 30 mL de líquido, água pura ou licor (~ 42% v / v etanol), para facilitar a inalação simultânea, conforme indicado na Figura 1B, C.
11. Comece a gravar usando as câmeras em 2 smartphones colocados nos suportes do telefone em cada terminal.
    NOTA: As especificações dos vídeos são as seguintes: largura do quadro, 1920; altura do quadro, 1080; taxa de dados, 20745 kbps; taxa de quadros, 30,00 quadros por segundo (fps).
12. Coloque cuidadosamente os 2 irmãos de ninhada treinados de camundongos na plataforma de estudo comportamental animal projetada a partir do topo e prenda imediatamente a gaiola com a placa superior.
    NOTA: Certifique-se de que esta etapa seja concluída em 15 s.
13. Grave cada vídeo por 2-3 min.
    NOTA: Certifique-se de que toda a duração do experimento, desde a preparação da mistura de manteiga de amendoim e wasabi até a conclusão da gravação do vídeo, seja limitada a 5 min.
14. Repita todo o experimento 3 vezes.
    NOTA: Certifique-se de que cada réplica do experimento seja separada por pelo menos 6 h.
15. Imite diferentes cenários.
    NOTA: Por exemplo, neste trabalho, um par de camundongos foi usado em 4 grupos com 4 cenários diferentes que foram imitados usando a configuração experimental descrita acima. Esses cenários incluem o Cenário A para o estudo de fundo, o Cenário B para o estudo de controle positivo, o Cenário C para o estudo de interação sabor-cheiro de wasabi-álcool e o Cenário D para o estudo de controle negativo. A Tabela 1 fornece um resumo desses cenários.

3. Reconhecimento de imagem

Semelhante a muitos estudos sobre processamento de imagens 23,24,25, um modelo de classificação foi obtido treinando uma CNN. O script para operações DL foi escrito em Python v.3.10 no Jupyter Notebook (anaconda3). Ele está disponível no seguinte repositório GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Para construir e treinar a CNN, bibliotecas de código aberto foram usadas, incluindo numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 e keras v.2.11.0. Essas bibliotecas forneceram as ferramentas e funcionalidades necessárias para desenvolver e treinar a CNN para reconhecimento de imagem.

1. Exporte uma série de imagens de quadro de vídeo dos videoclipes coletados para gerar um conjunto de dados para treinamento de modelo usando o Jupyter Notebook fornecido, chamado Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Selecione apenas as imagens com pelo menos 1 mouse consumindo a pasta fornecida. Exemplos das imagens selecionadas são fornecidos na Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5, Figura Suplementar 6 e Figura Suplementar 7.
3. Execute o aumento de dados invertendo horizontalmente as imagens geradas implementando o script fornecido no Jupyter Notebook, chamado Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Reserve os dados de imagem de cada segunda replicação para validação de modelo CNN independente externo. Use as imagens de cada primeira e terceira réplicas para treinamento e teste de modelo interno.
5. Pré-processe os dados de imagem usados na modelagem CNN executando o script no Jupyter Notebook, chamado Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluindo redimensionamento de imagem, conversão de cor preta e normalização de sinal de imagem.
6. Divida os materiais de treinamento em conjuntos de dados internos de treinamento e teste de forma aleatória de 8:2.
7. Inicialize a arquitetura da CNN. Projete o número de saídas da CNN com base no número de cenários a serem examinados.
   NOTA: Por exemplo, neste estudo, a rede neural foi designada para classificar 3 classes. Certifique-se de que o script para lidar com o desequilíbrio de dados no peso da classe seja compilado.
8. Encontre a combinação de hiperparâmetros que produz perda mínima nas amostras de teste internas para construção de CNN.
9. Adote a combinação ideal de hiperparâmetros para construir a arquitetura CNN.
10. Abra os Jupyter Notebooks fornecidos Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb e Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Valide o modelo obtido usando as imagens independentes (originais e invertidas) da segunda réplica do experimento comportamental animal.
11. Implante o modelo obtido e validado para classificar as imagens de quadro de vídeo geradas a partir do grupo experimental usando o Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Por exemplo, é o cenário C neste trabalho.

4. Pontuação manual da escala de caretas do mouse

NOTA: Para validar os insights fornecidos pela predição do modelo CNN, outro método previamente desenvolvido e validado por Langford et al. foi aplicado¹⁶. Este método envolve a pontuação do MGS com base nas 5 unidades de ação facial (AUs) específicas do camundongo: aperto orbital, protuberância do nariz, protuberância da bochecha, orelhas apertando para fora e mudança de bigode. Cada UA recebe uma pontuação de 0, 1 ou 2, indicando a ausência, presença moderada ou presença óbvia da UA, respectivamente. Este sistema de pontuação permite a quantificação e escalonamento de cada UA para avaliar o nível de nocicepção ou desconforto experimentado pelos camundongos.

1. Capture 3 imagens de quadro de vídeo dos irmãos de ninhada ingerindo a pasta para cada videoclipe. Certifique-se de que cada quadro esteja separado por pelo menos 3 segundos.
2. Codifique cegamente e reordene aleatoriamente imagens de diferentes classes de cenários em sequência usando o arquivo de modelo fornecido chamado "shuffleSlides.pptm" (Arquivo Suplementar 1) e executando o código de macro inserido.
3. Convide pelo menos 10 palestrantes para pontuar as imagens de amostra.
4. Treine os membros do painel para pontuar amostras de imagem usando o MGS. Fornecer aos painelistas materiais de treinamento que incluam o artigo original sobre MGS e seu manual^15,16.
5. Calcule a pontuação MGS de cada animal em um quadro capturado, calculando a média de todos os pontos de pontuação das 5 AUs faciais correspondentes. Apresente o escore MGS como a média ± erro padrão de medida (EPM).
6. Determine se existem diferenças estatisticamente significativas entre diferentes classes de cenários por análise de variância (ANOVA) unidirecional com o teste post-hoc de comparação múltipla de Bonferroni.
   NOTA: Um valor de P < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O principal objetivo deste estudo é estabelecer uma estrutura robusta para investigar a interação paladar-cheiro em camundongos. Essa estrutura incorpora o uso de inteligência artificial e QBA para desenvolver um modelo de classificação preditiva. Além disso, os insights obtidos da DL são validados com uma avaliação quantitativa do MGS para uma análise interna independente. A principal aplicação desta metodologia é examinar a extensão da supressão da nocicepção invocada pelo wasabi quando os camundongos...

Discussão

O método proposto para estudar a interação paladar-olfato neste trabalho é baseado no método original de codificação comportamental para expressão facial de dor em camundongos, desenvolvido por Langford et ^al.16. Vários artigos publicados recentemente introduziram a CNN para rastreamento automático de rosto do mouse e subsequente pontuação MGS 21,26,27,28. A ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU