通过测量人纯化血小板中的磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放来表征促凝血小板

摘要

促凝血小板形成与血栓形成风险增加相关。这里介绍的是从人血中分离洗涤血小板的精确方案，旨在量化磷脂酰丝氨酸的暴露和微泡释放，这是促凝血小板的显着特征。

摘要

活化的血小板主要通过暴露其外膜表面的促凝血磷脂磷脂酰丝氨酸 （PS） 并释放表达 PS 的微泡来促进凝血，这些微泡保留了其起始细胞的原始膜结构和细胞质成分。磷脂酰丝氨酸的可及性促进了主要凝血因子的结合，显着放大了凝血酶的催化效率，而微泡释放则充当细胞间信号传导的关键介质。促凝血小板在止血过程中的凝块稳定中起着至关重要的作用，它们在血流中比例的增加与血栓形成风险的增加相关。研究还表明，血小板微泡富含促进伤口愈合和炎症调节的生长因子。使用流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放带来了重大挑战，因为它们体积小且目标标志物的阳性事件数量有限。尽管在过去十年中取得了长足的进步，但评估磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放的方法仍在进行中。遗憾的是，不存在单一的普遍适用的方案，必须评估多个因素以确定最适合每个特定应用的方法。在这里，我们描述了从人血中分离洗涤血小板的详细方案，然后进行胶原蛋白和/或凝血酶活化，以测量促凝血小板特征的磷脂酰丝氨酸的暴露和微泡释放。该方案旨在促进富含血小板的血浆的初始制备和洗涤血小板的分离。最后，通过流式细胞术定量磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放，从而能够鉴定促凝血小板。

引言

血小板促凝血剂的形成对于维持止血至关重要 ^1,2,3。这个过程涉及激动剂诱导的磷脂在血小板膜上的表达，这对于 tenase 和凝血酶原酶复合物的组装至关重要 ^1,3,4。血小板活化后，血小板微泡也会不断释放 ^5,6。微泡（直径 50 nm 至 1 μm 以上）封装了起始细胞的膜结构和细胞质成分 ^7,8。微泡是细胞间信号转导的重要介质 ^9,10，^也是促进伤口愈合和炎症调节的生长因子的储存库^11,12。也有人认为微泡的促凝血能力是活化血小板的 50 至 100 倍¹³。值得注意的是，最近的证据表明，储存的血小板被激活，导致微泡的产生——这对血小板输注治疗的实践有潜在的影响。微泡延长的储存时间和增强的促凝血活性使它们成为输血应用中血小板的有前途的替代品¹⁴。

已经进行了方法学创新，以直接或间接评估健康和疾病条件下的血小板促凝血形成 ^4,14,15。使用纯化血小板评估磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放，提供了有关血小板促凝反应在不同人类疾病中如何受到干扰的新数据 ^1,4。这个不断增长的研究领域也为治疗干预开辟了途径 ^1,4。然而，从血液中分离和分析纯化的血小板非常耗时，需要专门的实验室设备，因此目前不适用于常规临床诊断^16,17。分析磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放也具有挑战性，因为它们体积小且目标标志物的阳性事件数量众多^18,19。

流式细胞术利用荧光 Annexin-V 结合，自 20 年前问世以来一直是评估血小板和微泡上 PS 表达的基石²⁰。它在促凝血小板和微泡的检查中获得了广泛的认可^21,22。因此，这里提出了一种优化的方案，可用于使用 Cazenave 小组²³ 开发的技术从血液样品中分离纯化的血小板，以及随后在血小板活化后通过流式细胞术表征磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放²⁴。该方案将有助于进一步研究和深入表征感兴趣的临床人群中的促凝血小板。

研究方案

该方案遵循指南，并获得了波尔多大学医院人类研究伦理委员会的批准。血液样本是从提供知情同意的健康志愿者那里获得的，这些样本根据机构方案进行处理。如果在实验前 10 天内服用了任何可能影响血小板功能的物质，则排除了这些物质的供体。获得健康志愿者的知情同意，以采集他们的血液并发布他们的数据。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 采血和制备洗涤后的血小板

1. 丢弃前 3 mL 后，在含有活性抗凝剂柠檬酸三钠与柠檬酸和葡萄糖 （ACD） 的收集管中收集外周静脉血。
2. 收集后，轻轻倒置试管，将血液与 ACD 混合，并在离心前让混合物在室温下静置 15 分钟。
3. 离心前使用自动细胞计数器对血小板进行计数，以确定正确的离心速度（表 1）。通过在室温 （RT） 下以 250 x g 离心 10 分钟制备富血小板血浆 （PRP），而不使用制动器以优化血小板回收。
   注:此步骤将在样品中产生三层:上层包含血浆、血小板和少量白细胞;富含白细胞的中间层;以及由红细胞组成的底层。小心地将 PRP 从上层转移到新的 50 mL 锥形管中，以避免红细胞和白细胞污染。
4. 向 PRP 中，每 9 mL 添加 1 mL ACD-A（见 表 2）和 6.25 μL 双磷酸腺苷双磷酸酶。
   注:浓度为 0.02 U/mL 的双磷酸腺苷双磷酸酶降解血小板分泌的微量 ATP 或 ADP，从而防止血小板 ADP 受体脱敏并保持血小板形状²⁵。前列环素 PGI2 抑制剂 （0.5 μM） 也可包含在 apyrase 中，以防止血小板活化。
5. 通过在 RT 下以 1100 x g 离心 10 分钟来制备血小板沉淀。使用温和的方法（例如巴斯德移液管）吸出含有血小板贫血浆 （PPP） 的上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中（参见 表 3 和 表 4）。用移液管轻轻匀浆，然后再加入 3-4 mL 洗涤缓冲液。
   注意:钙水平降低以防止血浆中存在的凝块因子凝结。在这个阶段，贫血小板血浆已被完全去除，防止凝血块形成和凝血酶产生血小板活化。
6. 在 RT 下以 1100 x g 再次离心 10 分钟。吸出上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。将 150 μL 血小板悬液转移到 1.5 mL 试管中，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。然后，用 3-4 mL 洗涤缓冲液重悬沉淀。
7. 以 1100 x g 的离心速度离心 10 分钟（在 RT 下）。吸出上清液，并将血小板沉淀重悬于一定体积的反应缓冲液中（参见 表 5 和 表 6），以达到 5 x 10¹¹ 个血小板/L 的最终浓度。
8. 在实验前让洗涤后的血小板静置至少 30 分钟，以使残留的抑制剂消失并使血小板适应缓冲液。

2. 检测试剂盒制备

1. 在反应缓冲液中准备所有激动剂和荧光染料。将 5 μL 凝血酶加入 45 μL 缓冲液中（稀释度 1:10），将 5 μL 离子载体加入 495 μL 缓冲液中（稀释度 1:500）。
   1. 对于内部检测，将未活化的血小板与用单联动剂和双联激动剂治疗的血小板进行基准比较。以不同的等分试样将 100 μL 50 x 10⁹ 个血小板/L 的洗涤血小板添加到:（i） 10 μL 反应缓冲液，（ii） 3 μL 未稀释的胶原蛋白（终浓度为 30 μg/mL），（iii） 10 μL 预稀释的凝血酶 （0.5 IU/mL），（iv） 3 μL 未稀释的胶原蛋白 + 10 μL 预稀释的凝血酶，以及 （v） 10 μL 预稀释的离子载体（终浓度为 2 μM）， 如前所述，已知这会直接增加细胞内钙水平²⁶。
      注意:用钙离子载体（如 A23187 或离子霉素）处理至关重要，因为它会诱导广泛的磷脂膜扰乱和增强的 PS 外化。
   2. 用手轻轻摇动每个等分试样，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。
      注:较长的激动剂孵育（30 分钟）可能在流式细胞术分析过程中更好地区分血小板群。
2. 向每个微管中加入 5 μL 未稀释的 Annexin-V FITC，并在室温下避光孵育 10 分钟。
   注:也可以包括针对血小板特异性受体之一 GPIX （CD42b） 或 αIIb 整合素 （CD41， GPIIb） 的单克隆抗体，以更好地识别血小板细胞。
3. 加入 500 μL 反应缓冲液以停止该过程，并使用流式细胞仪继续分析样品。

3. 通过流式细胞术 （FC） 表征促凝血小板和微泡

注:为了获得可靠的血小板功能分析，请使用根据既定标准²⁷ 配置的流式细胞术 （FC） 仪器。仪器必须能够检测前向散射 （FSC） 和至少一个荧光信号。将光散射和荧光检测器设置为对数增益。适当稀释样品以进行 FC，以确保仅以降低的数据采集速度对单个血小板进行计数。

1. 将流式细胞仪设置为"慢速"流速，阈值至少为 10,000 个血小板事件。使用 FITC 的通滤光片监测荧光发射。
2. 使用前向散射 （FSC） 对血小板群进行门控。根据血小板的大小检查血小板和释放的微泡。使用密度图来识别静息血小板和刺激血小板的血小板和释放的微泡;独立分析每个门控总体。
3. 根据 FL1 轴区分促凝血小板。将负临界值放在处于静止状态（即，在反应缓冲液存在下）血小板群的最右侧。血小板活化后，将位于该临界值右侧的所有事件分类为暴露磷脂酰丝氨酸的血小板。
4. 通过其独特的光散射特性区分比血小板小的微泡。将临界值设置为在静息血小板群中观察到的最低 FSC 值。激活后，将任何低于此阈值的磷脂酰丝氨酸阳性事件分类为微泡。
   注意:如有必要，通过调整临界值来考虑血小板大小的个体变化。确保静止状态下存在少于 1% 的微泡。

结果

使用 Annexin-V 染色实现促凝血小板和微泡的定量，每个样品至少记录 50,000 个事件。如步骤 2.2 中所述，基线血小板测量值取自与反应缓冲液孵育的样品，如图 1A 所示。使用中位前向散射 （FSC） 值测量血小板大小。虽然 FSC 受多种因素影响，但它仍然是细胞大小估计的常见指标，包括血小板的估计。面积密度图 （图 1A） 用于?...

讨论

最近对促凝血小板的研究强调了它们在几种疾病中的变化 ^1,28,29，强调了其详细分析和表征的重要性 30,31,32。虽然目前用于评估血小板促凝血形成的临床测试有限，但在过去二十年中，临床兴趣显着增加。例如，钙依赖性加扰酶 TMEM...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(CD42b, GPIX) APC	Beckman Coulter	B13980
ACD-A blood collection tubes	BD Vacutainer	366645
Annexin-V FITC	BD Pharmingen	560931
Apyrase Grade VII	Sigma-Aldrich	A6410
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma-Aldrich	A9576
CaCl2, 0.25M	Sigma-Aldrich	C3881
Citric acid monohydrate	Merck	5949-29-1
Collagen	Stago	86924
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
Ionophore	Calbiochem/VWR	100105
KCl	Merck	7447-40-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
NaCl	VWR	27810.295
NaOH	Merck	1.06498
Sodium hydrogen carbonate	Merck	6329	NaHCO3
Thrombin	Hyphen Biomed	EZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	G8270	Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7	Beckman Coulter	6607115