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Resumen

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Resumen

Las plaquetas activadas promueven la coagulación principalmente al exponer el fosfolípido procoagulante fosfatidilserina (PS) en las superficies de sus membranas externas y liberar microvesículas que expresan PS que conservan la arquitectura de membrana original y los componentes citoplasmáticos de sus células de origen. La accesibilidad de la fosfatidilserina facilita la unión de los principales factores de coagulación, amplificando significativamente la eficiencia catalítica de las enzimas de coagulación, mientras que la liberación de microvesículas actúa como un mediador fundamental de la señalización intercelular. Las plaquetas procoagulantes desempeñan un papel crucial en la estabilización del coágulo durante la hemostasia, y su mayor proporción en el torrente sanguíneo se correlaciona con un mayor riesgo de trombosis. También se ha demostrado que las microvesículas plaquetarias son ricas en factores de crecimiento que promueven la cicatrización de heridas y la modulación inflamatoria. El análisis de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas mediante citometría de flujo plantea desafíos significativos debido a su pequeño tamaño y al número limitado de eventos positivos para los marcadores de interés. A pesar de los considerables avances logrados en la última década, los métodos para evaluar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas siguen siendo un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no existe un único protocolo universalmente aplicable, y se deben evaluar varios factores para determinar la metodología más apropiada para cada aplicación específica. En este artículo, describimos un protocolo detallado para aislar las plaquetas lavadas de la sangre humana, seguido de la activación del colágeno y/o la trombina, para medir la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas que caracterizan a las plaquetas procoagulantes. Este protocolo está diseñado para facilitar la preparación inicial del plasma rico en plaquetas y el aislamiento de las plaquetas lavadas. Por último, la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas se cuantifican mediante citometría de flujo, lo que permite la identificación de plaquetas procoagulantes.

Introducción

La formación de procoagulantes plaquetarios es crucial para mantener la hemostasia 1,2,3. Este proceso implica la expresión de fosfolípidos inducidos por agonistas en la membrana plaquetaria, que es esencial para el ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa 1,3,4. Después de la activación plaquetaria, las microvesículas plaquetarias también se liberan continuamente 5,6. Las microvesículas (de 50 nm a más de 1 μm de diámetro) encapsulan tanto la estructura de la membrana como los constituyentes citoplasmáticos de las células de origen 7,8. Las microvesículas son importantes mediadores de la señalización intercelular 9,10 y también repositorios de factores de crecimiento que promueven la cicatrización de heridas y la modulación inflamatoria11,12. También se ha sugerido que las microvesículas son de 50 a 100 veces más procoagulantes que las plaquetas activadas13. En particular, la evidencia reciente sugiere que las plaquetas almacenadas se activan, lo que lleva a la producción de microvesículas, lo que tiene ramificaciones potenciales para la práctica de la terapia de transfusión de plaquetas. La duración prolongada del almacenamiento de las microvesículas y su mayor actividad procoagulante las convierten en un sustituto prometedor de las plaquetas en aplicaciones transfusionales14.

Se han realizado innovaciones metodológicas para, directa e indirectamente, evaluar la formación de procoagulantes plaquetarios tanto en condiciones de salud como de enfermedad 4,14,15. Las evaluaciones de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas utilizando plaquetas purificadas han proporcionado nuevos datos sobre cómo se perturban las respuestas procoagulantes plaquetarias en diversas enfermedades humanas 1,4. Este creciente campo de investigación también abre vías para las intervenciones terapéuticas 1,4. Sin embargo, el aislamiento y el análisis de las plaquetas purificadas de la sangre requieren mucho tiempo, requieren equipos de laboratorio especializados y, por lo tanto, actualmente no son adaptables para el diagnóstico clínico de rutina16,17. El análisis de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas también es un desafío debido a su pequeño tamaño y al número de eventos positivos para los marcadores de interés18,19.

La citometría de flujo, aprovechando la unión fluorescente a la anexina-V, ha sido una piedra angular en la evaluación de la expresión de PS en plaquetas y microvesículas desde su inicio hace dos décadas20. Ha ganado una amplia aceptación en el examen de plaquetas y microvesículas procoagulantes21,22. Por lo tanto, se presenta un protocolo optimizado que puede ser utilizado para el aislamiento de plaquetas purificadas a partir de muestras de sangre utilizando la técnica desarrollada por el grupo23 de Cazenave, y la posterior caracterización de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas por citometría de flujo después de la activación plaquetaria24. Este protocolo facilitará el estudio posterior y la caracterización en profundidad de las plaquetas procoagulantes en poblaciones clínicas de interés.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices y fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Humana del Hospital Universitario de Burdeos. Se obtuvieron muestras de sangre de voluntarios sanos que dieron su consentimiento informado, y estas muestras se procesaron de acuerdo con los protocolos institucionales. Se excluyó a los donantes que habían tomado cualquier sustancia que pudiera afectar la función plaquetaria si dichas sustancias se habían tomado dentro de los 10 días anteriores a los experimentos. Se obtuvo el consentimiento informado de voluntarios sanos para recolectar su sangre y publicar sus datos. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extracción de sangre y preparación de plaquetas lavadas

  1. Recoja la sangre venosa periférica en tubos de recolección que contengan el anticoagulante activo Citrato trisódico con ácido cítrico y dextrosa (ACD) después de desechar los primeros 3 mL.
  2. Después de la recolección, invierta suavemente el tubo para mezclar la sangre con ACD y deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación.
  3. Cuente las plaquetas utilizando un contador de células automatizado antes de la centrifugación para determinar la velocidad correcta de centrifugación (Tabla 1). Prepare plasma rico en plaquetas (PRP) por centrifugación a 250 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) sin aplicar el freno para optimizar la recuperación de plaquetas.
    NOTA: Este paso producirá tres capas en la muestra: la capa superior que contiene plasma, plaquetas y una pequeña fracción de glóbulos blancos; una capa intermedia enriquecida con glóbulos blancos; y una capa inferior formada por glóbulos rojos. Transfiera con cuidado el PRP de la capa superior a un nuevo tubo cónico de 50 ml para evitar la contaminación con glóbulos rojos y blancos.
  4. Al PRP, añadir 1 mL de ACD-A (ver Tabla 2) y 6,25 μL de apirasa por 9 mL.
    NOTA: La apirasa, a una concentración de 0,02 U/mL, degrada las trazas de ATP o ADP secretadas por las plaquetas, impidiendo así la desensibilización de los receptores plaquetarios de ADP y manteniendo la forma plaquetaria25. También se puede incluir un inhibidor de la prostilina PGI2 (0,5 μM) con la apirasa para prevenir la activación plaquetaria.
  5. Prepare el pellet de plaquetas por centrifugación a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspire el sobrenadante que contiene plasma pobre en plaquetas (PPP) utilizando un método suave, como una pipeta Pasteur, y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de tampón de lavado (ver Tabla 3 y Tabla 4). Homogeneizar suavemente con una pipeta, luego agregue 3-4 mL adicionales de tampón de lavado.
    NOTA: El nivel de calcio se reduce para evitar la coagulación con factores de coágulo presentes en el plasma. En esta etapa, el plasma pobre en plaquetas se ha eliminado por completo, lo que evita la formación de coágulos y la activación de plaquetas por la producción de trombina.
  6. Vuelva a centrifugar a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 mL de tampón de lavado. Transfiera 150 μL de la suspensión de plaquetas a un tubo de 1,5 mL para el recuento de células utilizando un contador de células automatizado. A continuación, vuelva a suspender el pellet con 3-4 mL de tampón de lavado.
  7. Realice una centrifugación final a 1100 x g durante 10 min (a RT). Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de plaquetas en un volumen de tampón de reacción (ver Tabla 5 y Tabla 6) para lograr una concentración final de 5 x 1011 plaquetas/L.
  8. Deje reposar las plaquetas lavadas durante al menos 30 minutos antes de los experimentos para permitir que los inhibidores residuales desaparezcan y que las plaquetas se aclimaten al tampón.

2. Preparación del ensayo

  1. Prepare todos los agonistas y fluorocromos en el tampón de reacción. Añadir 5 μL de trombina a 45 μL de tampón (dilución 1:10) y 5 μL de ionóforo a 495 μL de tampón (dilución 1:500).
    1. En el caso de los ensayos internos, se comparan las plaquetas no activadas con las tratadas con agonistas simples y dobles. Añadir, en diferentes alícuotas, 100 μL de plaquetas lavadas a 50 x 109 plaquetas/L a: (i) 10 μL de tampón de reacción, (ii) 3 μL de colágeno no diluido (concentración final de 30 μg/mL), (iii) 10 μL de trombina prediluida (0,5 UI/mL), (iv) 3 μL de colágeno no diluido + 10 μL de trombina prediluida, y (v) 10 μL de ionóforo prediluido (concentración final de 2 μM), que se sabe que aumenta directamente los niveles de calcio intracelular como se señaló anteriormente26.
      NOTA: El tratamiento con un ionóforo de calcio, como A23187 o ionomicina, es fundamental, ya que induce una amplia alteración de la membrana de fosfolípidos y una mayor externalización de PS.
    2. Agite suavemente cada alícuota con la mano e incube a 37 °C durante 5 min.
      NOTA: La incubación agonista más prolongada (30 min) puede permitir una mejor diferenciación entre las poblaciones de plaquetas durante el proceso de análisis por citometría de flujo.
  2. Añadir 5 μL de Anexina-V FITC no diluida a cada microtubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.
    NOTA: También se podría incluir un anticuerpo monoclonal contra uno de los receptores específicos de plaquetas, GPIX (CD42b) o integrina αIIb (CD41, GPIIb), para identificar mejor las células plaquetarias.
  3. Añada 500 μL de tampón de reacción para detener el proceso y proceda al análisis de la muestra con un citómetro de flujo.

3. Caracterización de plaquetas y microvesículas procoagulantes por Citometría de Flujo (FC)

NOTA: Para un análisis confiable de la función plaquetaria, utilice un instrumento de citometría de flujo (FC) configurado de acuerdo con los estándares establecidos27. El instrumento debe ser capaz de detectar dispersión directa (FSC) y al menos una señal de fluorescencia. Ajuste los detectores de dispersión de luz y fluorescencia a ganancia logarítmica. Diluya las muestras de forma adecuada para la FC para asegurarse de que solo se cuentan las plaquetas individuales a una velocidad de adquisición de datos reducida.

  1. Ajuste el citómetro de flujo a un caudal "lento" con un umbral de al menos 10.000 eventos plaquetarios. Monitoree la emisión de fluorescencia utilizando un filtro de paso para FITC.
  2. Controlar la población de plaquetas mediante dispersión directa (FSC). Examine las plaquetas y las microvesículas liberadas de acuerdo con sus tamaños. Utilice gráficos de densidad para identificar las plaquetas y las microvesículas liberadas tanto para las plaquetas en reposo como para las estimuladas; Analice cada población cerrada de forma independiente.
  3. Distinguir las plaquetas procoagulantes según el eje FL1. Coloque el punto de corte negativo en el extremo derecho de la población de plaquetas en estado de reposo (es decir, en presencia de tampón de reacción). Después de la activación plaquetaria, clasifique todos los eventos localizados a la derecha de este punto de corte como plaquetas que exponen fosfatidilserina.
  4. Diferenciar las microvesículas, al ser más pequeñas que las plaquetas, por sus características únicas de dispersión de la luz. Establezca el punto de corte en el valor más bajo de FSC observado en la población de plaquetas en reposo. Después de la activación, clasifique cualquier evento positivo para fosfatidilserina que caiga por debajo de este umbral como microvesículas.
    NOTA: Tenga en cuenta la variación individual en el tamaño de las plaquetas ajustando el corte si es necesario. Asegúrese de que menos del 1% de las microvesículas estén presentes en el estado de reposo.

Resultados

La cuantificación de plaquetas y microvesículas procoagulantes se logra mediante la tinción con anexina-V, con al menos 50.000 eventos registrados por muestra. Como se indicó en el paso 2.2, las mediciones de plaquetas de referencia se tomaron de muestras incubadas con tampón de reacción, como se muestra en la Figura 1A. El tamaño de las plaquetas se midió utilizando el valor de la mediana de dispersión directa (FSC). Si bien el FSC está influencia...

Discusión

Estudios recientes sobre plaquetas procoagulantes han puesto de manifiesto sus cambios durante varias enfermedades 1,28,29, subrayando la importancia de su análisis detallado y caracterización 30,31,32. Si bien las pruebas clínicas actuales para evaluar la formación de procoagulantes plaquetarios so...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Ninguno.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

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