基于贻贝 （Mytilus galloprovincialis） 血细胞运动的毒理学和生态毒理学测定

摘要

本文提出了一种新的 体外 方法，用于基于 Mytilus galloprovincialis 血细胞的运动性快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。该方法旨在促进开发更合乎道德和更敏感的毒理学和生态毒理学暴露测试。

摘要

血细胞是双壳类软体动物中循环的免疫活性细胞，在细胞介导的先天免疫的几个重要功能中起关键作用。在免疫反应的早期阶段，血细胞主动迁移到感染部位。这种固有的运动是这些细胞的基本特征。它代表了一种关键的细胞功能，整合了多个过程，例如细胞粘附、细胞信号传导、细胞骨架动力学和细胞体积的变化。因此，暴露于药物或污染物后细胞运动的改变可以作为有用的毒理学终点。尽管细胞运动在细胞生理学中起着重要作用，但从毒理学的角度来看，它的研究却很差。这项工作在评价 Mytilus galloprovincialis 的血细胞运动的基础上，提出了一种新的体外方法，用于快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。我们开发了一种对粘附在 96 孔聚苯乙烯微孔板底部的血细胞的细胞运动测定法。在暴露于浓度不断增加的药物后，通过在延时显微镜下通过细胞追踪量化细胞轨迹和速度，使我们能够测量对血细胞运动的影响。由于易于以相对非侵入性的方式从动物中收集血细胞，因此所提出的方法为筛选污染物和药物的影响和作用机制提供了一种替代测试。它符合 3R（替代、减少和改进）标准，解决了道德问题，并有助于减少脊椎动物体内动物试验。

引言

基于效果的方法，例如体外和体内生物测定，代表了检测环境化学污染物对生物体的影响并将其用作环境监测和风险评估工具的创新工具 1,2,3,4。它们通过克服经典分析化学方法的一些局限性来补充经典分析化学方法。例如，基于效果的方法可以评估污染物的生物利用度、它们对生物体健康的影响以及混合物的综合毒理学影响。仅凭化学分析可能无法预测这些综合效应⁵。

近年来，新兴污染物（新兴污染物）的生态毒理学代表了一个领域，基于效果的方法可以成为检测暴露和评估对生物群影响的有用工具1,5,6,7。几种基于效果的方法使用双壳类软体动物作为环境监测和评估中的测试生物 ^8,9。一些特性使这些生物体适合进行生态毒理学研究，例如它们的广泛分布、滤食性质、无柄生活方式、多种环境污染物的生物积累能力和对污染物产生可检测的反应的能力、与不同生命阶段一起工作的可能性，以及在实验室条件下维持^{的可能性 7}.它们对污染暴露高度敏感，并根据物种、生命阶段和环境条件对有毒污染物表现出各种反应 ^8,9,10。因此，一些环境指南使用双壳类物种作为标准化测试物种^10,11。

在双壳类软体动物中，广泛分布的 Mytilus galloprovincialis 是生态毒理学领域最常用的物种之一，因为它能够对化学污染暴露产生早期可检测的反应，包括金属硫蛋白诱导、抗氧化酶改变、溶酶体膜不稳定、脂质过氧化、脂褐素积累、微核频率增加、碳酸酐酶诱导 12,13,14^，15.血细胞是免疫活性血淋巴细胞，广泛用于研究环境污染物对双壳类软体动物的毒理学影响 4,13,16,17。这些细胞对生物体的免疫反应至关重要，执行细胞介导的先天免疫的几个重要功能。这些包括通过吞噬作用和各种细胞毒性反应消除微生物，例如溶酶体酶的释放、抗菌肽以及呼吸爆发期间氧代谢物的产生 18,19,20。血细胞是本质上运动的细胞 21,22,23，能够在生物体免疫反应的早期阶段迁移到感染部位。一般来说，运动是表征所有免疫细胞的基本特征，因为它使这些细胞的免疫监视能够保护身体²⁴。对各种软体动物物种的研究表明，血细胞运动是其免疫反应、伤口愈合和与病原体相互作用的关键组成部分。这种运动受特定分子途径的调节，突出了软体动物中血细胞功能的复杂性和特化 21,25,26,27。

尽管运动在血细胞生理学中具有根本重要性，但很少有研究调查血细胞运动对环境化学污染物的敏感性 23,28,29,30。最近，我们小组表征了 Mytilus galloprovincialis 血细胞在组织培养处理的聚苯乙烯 96 孔微孔板中的自发运动，并检查了血细胞运动对体外暴露于扑热息痛²³ 的敏感性。M. galloprovincialis 血细胞表现出基于板状伪足和快速形状变化的随机样细胞运动，正如之前在另一种贻贝物种 Mytilus edulis 21,22,23,28 中发现^的那样，并且已经在人类免疫细胞中描述过³¹。最近证明血细胞运动对化学应激源敏感^23,28。基于这些先前的发现，这项工作提出了一种新的体外方法，用于通过细胞运动的速度分析（平均速度、迁移距离、欧几里得距离和直接性的量化）来评估 M. galloprovincialis 血细胞的运动性及其改变，快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。该方法提供了在短期测定（持续 1-4 小时）或持续 24-48 小时的长时间暴露测定中体外筛选几种物质的毒性的可能性。

研究方案

所有实验均根据实施欧洲委员会理事会指令 （2010/63 EEC） 的意大利动物福利立法 （D.L.26/2014） 进行。 Mytilus galloprovincialis 是一种滤食性双壳类，通常被称为地中海贻贝。它原产于地中海和南欧的大西洋沿岸。它是被引入的，并广泛分布在北美西部、亚洲和南非。它是世界多个地区重要的商业渔业物种。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 人工海水 （ASTM） 或过滤天然海水的制备

1. 为了根据 ASTM D1141-98 （2021）³² 制备人工海水反潜战，将以下盐溶解在蒸馏水中（1 L 时为 g）：27.65 NaCl、0.133 NaHCO₃、3.33 MgCl₂·6H₂O， 2.66 Na₂SO₄， 0.733 氯化钙₂ ·2H₂O，0.466 KCl，0.067 KBr，0.02 H₃BO 3,0.013 SrCl₂·6H₂O，0.0019 NaF。ASW 溶液的 pH 值为 7.80。
2. 为了制备过滤后的天然海水 （FSW），用 0.2 μm 过滤器过滤从不受人为活动影响的地点收集的天然海水 37 PSU。

2. 动物驯化

1. 在实验使用前，将成年贻贝标本（Mytilus galloprovincialis Lam.）在含有充气ASW或FSW（1L /动物）的静态罐（饥饿）中在15°C的恒温室中驯化24小时。

3. 用于血细胞运动评估的试剂制备

1. 如上所述准备过滤海水 （FSW） 或标准生理盐水 （SPS）。将 HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪-乙磺酸）4.77 g、NaCl 25.48 g、MgSO₄ 13.06 g、KCl 0.75 g、CaCl₂ 1.47 g 溶于约 800 mL 蒸馏水中，然后加入更多的蒸馏水补成 1 L。用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.36。
2. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 20 mg/mL 的中性红储备液。
3. 制备中性红染色溶液：向 995 μL FSW 或 SPS 中加入 5 μL 中性红储备液。
4. 制备补充有 2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的 FSW 或 SPS，如下所示：将 100 μL 2 mM L-谷氨酰胺和 100 μL 青霉素/链霉素混合物添加到 10 mL FSW/SPS 中。
5. 在 FSW 或 SPS 中制备 0.4% 台盼蓝。
   注：根据 Martínez-Gómez 等人 ³³ 制备中性红储备液。中性红储备液在 2 °C 下储存时可持续约 3-4 周。 应在测定前制备中性红染色溶液和 0.4% 台盼蓝。

4. 血淋巴取样

1. 用 0.5 mL 过滤后的海水 FSW 或标准生理盐水 SPS（15 °C）预填充注射器。
2. 用手术刀沿腹面轻轻小心地撬开瓣膜。将手术刀保持在原位或使用移液器吸头。让皮下注射器的针头进入瓣膜之间的空间。
3. 根据 UNEP/RAMOGE³⁴，用预装注射器从后内收肌轻轻收集 0.5 mL 血淋巴液。
4. 从注射器中取出针头，将注射器的内容物转移到微管中。
5. 从 3-4 个贻贝中收集血淋巴液，并在 15 °C 下使用相同的个体比例将血淋巴样品汇集在试管中。
   注意：注射器的预填充用于在采样过程中立即以 1：1 稀释血淋巴液。根据 Martínez-Gómez 等人的说法，用 FSW 或 SPS 以 50：50 的比例稀释血淋巴液通常用于防止血细胞聚集³³。

5. 血细胞铺板和培养

1. 用血细胞计数器计数细胞。
2. 用 FSW 或 SPS 稀释浓度为 1 ×^{10 6} 个细胞/mL 的血淋巴液。
3. 通过台盼蓝染色评估悬浮液中血细胞的活力：将 100 μL 溶于 FSW 或 SPS 的 0.4% 台盼蓝添加到 100 μL 血细胞悬液中。在 15 °C 下孵育 5 分钟。
4. 接下来，在血细胞计数器中加入一滴悬浮液，并在显微镜观察下对未染色（活）和染色（非活）的细胞进行计数。
5. 评估血细胞活力，作为根据计数细胞总数计算的活细胞百分比³⁵。
6. 使用以下公式进行细胞活力评估³⁵：
   活细胞 （%） = [活细胞数/细胞总数（活细胞 + 非活细胞）] x 100
7. 确保血细胞活力应高于 95% 才能在方案中进一步进行。
8. 将 50 μL 稀释的血淋巴液加入细胞培养物 96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理的微孔板的每个孔中。用盖子盖住板。
9. 让血细胞在 15 °C 下粘附在孔底部 30 分钟以形成单层。
10. 用微量移液器轻轻吸出，去除多余的血淋巴液。

6. 短期检测

1. 对于短期测定（1-4 小时内），立即将粘附在孔底部的细胞与 100 μL 在 15 °C 下以不同浓度的 FSW 或 SPS 溶解的目标物质一起孵育。 至少使用三个孔对每个实验条件进行 3 次重复测定。
2. 孵育后，按照步骤 8 评估细胞运动。

7. 长时间暴露试验

1. 对于长时间暴露，即 24-48 小时暴露测定，在 15°C 下，将培养的贴壁细胞与补充有 2 mM L-谷氨酰胺 40 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的培养基（FSW 或 ASW）中溶解浓度递增的测试物质一起孵育。 至少使用三个孔对每个实验条件进行 3 次重复测定。
2. 孵育后，按照步骤 8 评估细胞运动。

8. 通过延时显微镜评估细胞运动

1. 将含有贴壁活血细胞的多孔板插入多功能读数仪中。
2. 通过延时显微镜在板上进行实时成像来评估贴壁活细胞的运动性：在每 1 分钟捕获 1 张图像的速率，在每个孔中捕获相同感兴趣区域 （ROI）（使用的 ROI 尺寸：720μm x 720μm） 的图像在 20 倍放大和彩色明场可视化下使用多功能阅读器，持续 10 分钟。
3. 为了更好地观察血细胞，请在延时显微镜检查之前用活性染料 Neutral Red 对细胞进行染色，如下所示：
   1. 从每个孔中取出孵育培养基。
   2. 将 100 μL 溶于含有目标物质的标准生理盐水中的中性红染色溶液加入含有贴壁细胞的板孔中。
   3. 将细胞在 15 °C 下孵育 15 分钟。洗掉多余的染料。
   4. 加入 100 μL 在 FSW 或 SPS 中分离的目标物质。可视化细胞以进行运动评估。
      注意：使用多功能阅读器可以从大量孔中同时采集图像，从而允许同时检测孔中包含的所有实验条件和重复。中性红色染料保留在溶酶体内，溶酶体在细胞质中显示为橙色小点，而细胞核则显示为半透明孔，因为嗜酸菌染料不会染色。在 20 °C 的室温下进行图像采集 10 分钟。

9. 细胞跟踪和测速参数计算

1. 通过图像 J 分析在延时显微镜下为每个孔获取的相同感兴趣区域的帧。
2. 将图像保存在名称中没有空格的文件夹中。图像可以是 JPEG 或 PNG 格式。
3. 打开 ImageJ。单击 File > Import > Image Sequence。
4. 使用 ImageJ 的 手动跟踪 插件对单个细胞进行细胞跟踪。单个单元格的位置在连续图像中标记，从而可以跟踪位置随时间的变化。
5. 每孔至少分析 40 个细胞，不包括从分析中逃脱记录区域的细胞。
6. 将数据集从 ImageJ 插件“手动跟踪”导入免费提供的趋化性和迁移工具软件。
7. 根据软件³⁶免费用户指南中报告的详细说明，使用 趋化性和迁移工具软件量化速度参数，例如平均速度、欧几里得距离、迁移距离和方向性或下面提供的步骤：
   1. 将数据集从 ImageJ 插件“手动跟踪”导入趋化性和迁移工具软件。
   2. 选择所需的切片数量（例如，用于跟踪的图像数量）。
   3. 通过设置 x/y 像素大小和时间间隔来校准软件。x/y 校准表示像素的边缘长度（以 μm 为单位），而时间间隔表示每个切片之间的持续时间。
   4. 调整值和参数后，单击 Apply Settings。
   5. 绘制轨迹并导出为图像。单击 Measured values 按钮查看测量值。省省吧。
   6. 单击 Statistics 按钮并保存轨道序列的速度和方向性。
8. 将对照细胞的计算速度参数与暴露于不同浓度测试物质的血细胞的测速参数进行比较。
   注意：迁移距离（以 μm 为单位）是指观察期间（10 分钟）迁移路径的长度。欧几里得距离（也以 μm 为单位）表示像元起点和终点之间的直线距离。平均速度（以 μm min ^-1 表示）计算为每个细胞的迁移距离与细胞跟踪持续时间的比率。直接性定义为每个轨迹的欧几里得距离与累积距离的比率。

结果

该研究引入了一种新的体外方法，用于利用 Mytilus galloprovincialis 血细胞的运动快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。图 1A-C 显示了附着到孔底部 30 分钟后血细胞的代表性延时成像。在运动评估之前，图中的细胞用中性红染色。使用光学显微镜以每分钟一张图像的速率监测细胞运动，持续 10 分钟，在 20 ?...

讨论

这项工作中描述的方案代表了一种新的体外方法，适用于基于评估 M. galloprovincialis 血细胞的运动性及其改变，快速灵敏地评估药物和污染物的毒性。运动是这些细胞免疫功能的一个特殊方面 21,22,23,37,38，因此细胞运动的任何改变都可能预示着这些细胞免疫功能的改变。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)	ABLUO		labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22G	Rays	2522CM32	labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplate	Corning	3916	labware
CaCl2.2H2O	Merk (Sigma - Aldrich)	C3881-1KG	Chemical
Chemotaxis and Migration Tool software	(Ibidi GmbH)		software
Cytation 5	Agilent BioTeck	Cytation 5	Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merk (Sigma - Aldrich)	472301	Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical Bottom	Corning	352196	labware
H3BO3	Merk (Sigma - Aldrich)	B0394	Chemical
Hemocytometer Fast read 102	Biosigma	BVS100	labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)	Merk (Sigma - Aldrich)	H3375-500G	Chemical
ImageJ software	NIH		software
KBr	Merk (Sigma - Aldrich)	P9881	Chemical
KCl	Merk	104936	Chemical
L-glutamine	Merk (Sigma - Aldrich)	G7513	Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2O	Merk (Sigma - Aldrich)	M2670	Chemical
MgSO4	Merk (Sigma - Aldrich)	M7506	Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600	Nikon		Equipment: Cell imaging
Na2SO4	Riedel-de Haen	31481	Chemical
NaCl	Merk (Sigma - Aldrich)	31434-1KG-R	Chemical
NaF	Fluka	71519 500g	Chemical
NaHCO3	Merk (Sigma - Aldrich)	S5761-1KG	Chemical
Neutral Red	Merk (Sigma - Aldrich)	N4638-1G	Vital cell dye
Penicillin/Streptomycin	Merk (Sigma - Aldrich)	P0781-100ML	Antibiotics for cell culture
SrCl2·6H2O	Merk (Sigma - Aldrich)	255521	Chemical
Trypan blue	Merk (Sigma - Aldrich)	T8154	Cell dye