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要約

この記事は、Mytilus galloprovincialis血球の運動性に基づいて、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を提案しています。この方法は、より倫理的で感度の高い毒物学的および生態毒性学的暴露試験の開発に貢献することを目的としています。

要約

血球は、二枚貝の軟体動物に分布する免疫コンピテント細胞であり、細胞性自然免疫のいくつかの重要な機能において重要な役割を果たしています。免疫応答の初期段階では、血球は積極的に感染部位に移動します。この固有の運動性は、これらの細胞の基本的な特性です。これは、細胞接着、細胞シグナル伝達、細胞骨格ダイナミクス、細胞体積の変化など、複数のプロセスを統合する重要な細胞機能を表しています。したがって、薬物や汚染物質への曝露後の細胞運動性の変化は、有用な毒物学的エンドポイントとして役立つ可能性があります。細胞生理学における細胞の運動性の基本的な役割にもかかわらず、毒物学の観点からは十分に研究されていません。この研究は、Mytilus galloprovincialisの血球運動性の評価に基づいて、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を提案しています。私たちは、96ウェルポリスチレンマイクロプレートの底に付着した血球に対する細胞運動アッセイを開発しました。薬物の濃度が増加した後、細胞の軌跡と速度をタイムラプス顕微鏡下での細胞追跡によって定量化し、血球の運動性への影響を測定することができました。比較的非侵襲的な方法で動物からの血球採取が容易であるため、提案された方法は、汚染物質および薬物の作用の影響および作用機序をスクリーニングするための代替試験を提供する。これは、3R(Replacement, Reduction, and Refinement)基準に準拠しており、倫理的な懸念に対処し、脊椎動物の生体内動物実験の削減に貢献しています。

概要

in vitroおよびin vivoバイオアッセイなどの効果ベースの方法は、生体内の環境化学汚染物質の影響を検出し、環境モニタリングおよびリスク評価のツールとして使用するための革新的なツールを表しています1,2,3,4。これらは、その制限のいくつかを克服することにより、従来の分析化学アプローチを補完します。例えば、効果ベースの方法では、汚染物質のバイオアベイラビリティ、汚染物質が生物の健康に及ぼす影響、混合物の複合的な毒性効果を評価することができます。これらの複合的な影響は、化学分析5のみに基づいて予測できない場合があります5。

近年、新たな懸念を持つ汚染物質(新興汚染物質)の生態毒性学は、影響ベースの方法が曝露を検出し、生物相への影響を評価するための有用なツールとなり得る分野を表しています1,5,6,7。いくつかの効果ベースの方法では、環境モニタリングと評価の試験生物として二枚貝の軟体動物を使用します8,9。これらの生物は、その広範な分布、濾過摂食の性質、固着した生活様式、広範囲の環境汚染物質の生体蓄積能力、汚染物質に対する検出可能な反応の開発能力、さまざまなライフステージでの作業の可能性、実験室条件下での維持など、いくつかの特性により生態毒性学的研究に適しています7.それらは汚染への曝露に対して非常に敏感であり、種、ライフステージ、および環境条件に応じて有毒汚染物質に対してさまざまな反応を示します8,9,10。したがって、いくつかの環境ガイドラインでは、標準化された試験種として二枚貝種を使用している10,11。

二枚貝の軟体動物の中で、広く分布しているMytilus galloprovincialisは、メタロチオネイン誘導、抗酸化酵素の変化、リソソーム膜の不安定化、脂質過酸化、リポフスチン蓄積、小核頻度の増加、炭酸脱水酵素誘導12,13,14、15.免疫担当リンパ細胞である血球は、二枚貝の軟体動物における環境汚染物質の毒物学的影響を研究するために広く使用されています4,13,16,17。これらの細胞は、生物の免疫応答に不可欠であり、細胞性自然免疫のいくつかの重要な機能を果たしています。これらには、食作用による微生物の排除や、リソソーム酵素、抗菌ペプチドの放出、および呼吸バースト中の酸素代謝産物の産生などのさまざまな細胞毒性反応が含まれます18,19,20。血球は、生物の免疫応答の初期段階で感染部位に移動することができる内在的に運動性細胞21,22,23である。一般に、運動性は、これらの細胞の免疫監視が身体を保護することを可能にするため、すべての免疫細胞を特徴付ける基本的な特徴である24。さまざまな軟体動物種にわたる研究は、血球の運動性が彼らの免疫応答、創傷治癒、および病原体との相互作用の重要な要素であることを示しています。この運動性は特定の分子経路によって制御されており、軟体動物21,25,26,27の血球機能の複雑さと特殊化を強調しています。

血球の生理学における運動性の根本的な重要性にもかかわらず、環境化学汚染物質23,28,29,30に対する血球の運動性の感受性を調査した研究はほとんどありません。最近、私たちのグループは、組織培養処理されたポリスチレン96ウェルマイクロプレートにおけるMytilus galloprovincialis血球の自発的な動きを特徴付け、パラセタモール23へのin vitro曝露に対する血球運動性の感受性を調べました。M. galloprovincialis血球は、以前に別の淡水産貝種であるMytilus edulis 21,22,23,28で見られたように、ラメリポディアと急速な形状変化に基づくランダムな細胞運動を示し、すでにヒト免疫細胞31に記載されている。血球の運動性は、最近、化学的ストレッサー23,28に敏感であることが実証されています。これらの先行研究結果に基づき、本研究では、細胞の運動性(平均速度、移動距離、ユークリッド距離、直接性の定量化)を通じて、M. galloprovincialis血球の運動性とその変化を評価することに基づいて、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を提案します。この方法は、短期アッセイ(1〜4時間持続)または24〜48時間持続する長期暴露アッセイのいずれかで、いくつかの物質の毒性をin vitroでスクリーニングする可能性を提供します。

プロトコル

すべての実験は、欧州委員会理事会指令(2010/63 EEC)を実施したイタリアの動物福祉法(D.L.26/2014)に基づいて実施されました。 Mytilus galloprovincialisは 、一般に地中海産ムール貝として知られている濾過摂食二枚貝です。地中海と南ヨーロッパの大西洋岸に自生しています。北米西部、アジア、南アフリカに導入され、広く普及しています。それは世界のいくつかの地域で重要な商業漁業種です。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 人工海水(ASTM)またはろ過された天然海水の調製

  1. ASTM D1141-98(2021)32に準拠した人工海水ASWの調製には、次の塩を蒸留水(1 Lのg)に溶解します:27.65 NaCl、0.133 NaHCO3、3.33 MgCl2·6H2O、2.66 Na2SO4、0.733 CaCl2 ·2H2O、0.466 KCl、0.067 KBr、0.02 H3BO3、0.013 SrCl2·6H2O、0.0019 NaF。ASW溶液のpHは7.80です。
  2. ろ過された天然海水(FSW)の調製には、0.2μmのフィルターを使用して人為的活動の影響を受けないサイトから収集された天然海水37 PSUをろ過します。

2.動物順応

  1. 成体の淡水産貝標本(Mytilus galloprovincialis Lam.)を、曝気されたASWまたはFSW(1 L /動物)を含む静的タンク(飢餓状態)で24時間、サーモスタットルームで15°Cで順応させてから使用してください。

3. 血球運動性評価のための試薬調製

  1. 上記のようにろ過された海水(FSW)または標準的な生理食塩水(SPS)を準備します。HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン-エタンスルホン酸)4.77g、NaCl 25.48g、MgSO4 13.06g、KCl 0.75g、CaCl2 1.47gを約800mLの蒸留水に溶解し、さらに蒸留水を加えて1Lまで調製する。pHを7.36に調整し、1 M NaOHを使用します。
  2. ジメチルスルホキシド(DMSO)に20 mg / mLの中性レッドストック溶液を調製します。
  3. 中性赤色染色液の調製:995 μLのFSWまたはSPSに5 μLの中性赤色ストック溶液を添加します。
  4. 次のように、2 mMのL-グルタミン、40 IU / mLのペニシリンG、および100 μg / mLのストレプトマイシンを補充したFSWまたはSPSを準備します:100 μLの2 mM L-グルタミンと100 μLのペニシリン/ストレプトマイシンミックスを10 mLのFSW / SPSに加えます。.
  5. 0.4%トリパンブルーをFSWまたはSPSに調製します。
    注:中性レッドストック溶液は、Martínez-Gómez et al.33に従って調製しました。ニュートラルレッドストック溶液は、4°Cで保存した場合、約2〜3週間持続します。 中性赤色染色溶液と0.4%トリパンブルーは、アッセイの直前に調製する必要があります。

4. 血リンパサンプリング

  1. 0.5 mLのろ過済み海水FSWまたは標準的な生理食塩水SPS(15°C)をシリンジにあらかじめ充填します。
  2. メスで腹面に沿って弁をわずかに慎重に離します。メスを所定の位置に保持するか、ピペットチップを使用します。皮下注射器の針が弁の間の空間に入るのを待ちます。.
  3. UNEP/RAMOGE34に従って、プレフィルドシリンジで後内転筋から0.5 mLの血リンパを静かに収集します。.
  4. シリンジから針を取り出し、シリンジの内容物をマイクロチューブに移します。
  5. 3〜4個のムール貝から血リンパを採取し、血リンパサンプルを15°Cのチューブにプールし、個体間で同じ比率でプールします。
    注:シリンジのプレフィルディングは、サンプリング中に血リンパを直ちに1:1に希釈するために使用されます。Martínez-Gómez et al.33によると、血リンパ液をFSWまたはSPSで50:50の比率で希釈することは、血球の凝集を防ぐために一般的に使用されます。

5. 血球のめっきと培養

  1. 血球計算盤で細胞を数えます。
  2. 血リンパ液をFSWまたはSPSで1×106 細胞/ mLの濃度で希釈します。.
  3. トリパンブルー染色による懸濁液中の血球の生存率の評価:FSWまたはSPSに溶解した0.4%トリパンブルー100μLを100μLの血球懸濁液に加えます。15°Cで5分間インキュベートします。
  4. 次に、血球計算盤に懸濁液を一滴加え、顕微鏡観察下で未染色(生存細胞)細胞と染色(非生存細胞)をカウントします。
  5. 血球の生存率を、カウントされた細胞35の総数に基づいて計算された生存細胞の割合として評価する。
  6. 細胞生存率評価35には、以下の式を使用します。
    生細胞数(%)=[生細胞数/総細胞数(生細胞+非生細胞)]×100
  7. プロトコルをさらに進めるには、血球の生存率が95%より高くなる必要があります。
  8. 希釈した血リンパ液50 μLを、細胞培養96ウェル平底ポリスチレンTC処理マイクロプレートの各ウェルに加えます。プレートを蓋で覆います。
  9. 血球をウェルの底に15°Cで30分間接着させて、単層を形成します。
  10. マイクロピペットで穏やかに吸引することにより、余分な血リンパを取り除きます。.

6. 短期アッセイ

  1. 短期アッセイ(1〜4時間以内)の場合は、ウェルの底に付着した細胞を、FSWまたはSPSで異なる濃度の15°Cで溶解した目的物質100μLと直ちにインキュベートします。 各実験条件の3回の反復測定には、少なくとも3つのウェルを使用してください。
  2. インキュベーション後、ステップ8に従って細胞の運動性を評価します。

7. 長期暴露アッセイ

  1. 長時間の曝露、すなわち24-48時間の曝露アッセイでは、培養培地(FSWまたはASW)に溶解した試験物質の濃度を上げながら培養接着細胞をインキュベートし、2 mM L-グルタミン40 IU/mLペニシリンGおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を15°Cで添加します。 各実験条件の3回の反復測定には、少なくとも3つのウェルを使用してください。
  2. インキュベーション後、ステップ8に従って細胞の運動性を評価します。

8. タイムラプス顕微鏡による細胞運動性評価

  1. 接着性生体血球を含むマルチウェルプレートをマルチモードリーダーに挿入します。
  2. タイムラプス顕微鏡によるプレート上のリアルタイムイメージングにより、接着生細胞の運動性を評価します:マルチモードリーダーを使用して、20倍の倍率とカラー明視野の視覚化で、各ウェル内の同じ関心領域(ROI)(使用されるROIの寸法:720μm x 720μm)の画像を1分ごとに10分間取得します。
  3. 血球をよりよく視覚化するには、次のように、タイムラプス顕微鏡検査の直前にバイタル色素Neutral Redで細胞を染色します。
    1. 各ウェルからインキュベーション培地を取り出します。
    2. 目的の物質を含む標準的な生理食塩水に溶解したニュートラルレッドの染色液100 μLを、接着細胞を含むプレートのウェルに加えます。
    3. 細胞を15°Cで15分間インキュベートします。余分な染料を洗い流します。
    4. FSWまたはSPSで溶解した目的物質100μLを添加します。運動性評価のために細胞を可視化します。
      注:マルチモードリーダーを使用すると、多数のウェルから画像を同時に取得でき、ウェルに含まれるすべての実験条件と複製の運動性を同時に検出できます。ニュートラルレッド色素はリソソーム内に保持され、リソソームは細胞質に小さなオレンジ色の斑点として現れますが、アシドフィルスバイタル色素はそれを染色しないため、核は半透明の穴として現れます。画像取得は、室温20°Cで10分間行いました。

9. 細胞追跡と速度測定パラメータの計算

  1. タイムラプス顕微鏡で取得した同じ関心領域のフレームを、各ウェルの画像Jで解析します。
  2. 名前にスペースを入れないフォルダーに画像を保存します。画像はJPEGまたはPNG形式のいずれかです。
  3. ImageJを開きます。[ファイル]>[画像シーケンス>インポート]をクリックします。
  4. ImageJ の マニュアルトラッキング プラグインを使用して、単一セルのセルトラッキングを実行します。個々のセルの位置は連続した画像でマークされるため、時間の経過に伴う位置の変化を追跡できます。
  5. ウェルあたり少なくとも40個の細胞を解析します(記録されたフィールドから逃れる細胞を除く)。
  6. ImageJプラグイン「Manual Tracking」から、無料で利用できるChemotaxisおよびMigration Toolソフトウェアにデータセットをインポートします。
  7. 平均速度、ユークリッド距離、移動距離、および直接性などの速度パラメータを、ソフトウェア36の無料で入手可能なユーザーガイドに記載されている詳細な手順に従って、走化性および移行ツールソフトウェアを使用して定量化するか、または以下に示す手順に従って定量化します。
    1. ImageJプラグインの「Manual Tracking」からChemotaxisおよびMigration Toolソフトウェアにデータセットをインポートします。
    2. 必要なスライス数(トラッキングに使用する画像の数など)を選択します。
    3. x/y ピクセル サイズと時間間隔を設定して、ソフトウェアを調整します。x/yキャリブレーションはピクセルのエッジ長をμm単位で示し、時間間隔は各スライス間の持続時間を表します。
    4. 値とパラメータを調整したら、[ 設定の適用]をクリックします。
    5. 軌道をプロットし、画像としてエクスポートします。 [測定値 ]ボタンをクリックして、測定値を確認します。保存します。
    6. [統計]ボタンをクリックして、トラックシリーズの速度と直接性を保存します。
  8. コントロール細胞について計算された速度測定パラメータを、異なる濃度で試験物質に曝露された血球のパラメータと比較します。
    注:移行距離(μmで測定)は、観測期間(10分)の移行経路の長さを指します。ユークリッド距離 (μm 単位も測定) は、セルの始点と終点の間の直線距離を表します。平均速度(μm min-1で表される)は、各セルのセル追跡期間に対する移動距離の比率として計算されます。直接性は、各軌跡の累積距離に対するユークリッド距離の比率として定義されます。

結果

この研究では、Mytilus galloprovincialis血液細胞の運動性を利用して、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を紹介します。図1A-Cは、ウェルの底に30分間付着した後の血球の代表的なタイムラプスイメージングを示しています。図中の細胞は、運動性評価の直前にニュー?...

ディスカッション

この研究に記載されているプロトコルは、M. galloprovincialis血球とその変化の運動性を評価することに基づいて、薬物および汚染物質の毒性を迅速かつ高感度に評価するのに適した新しいin vitro法を表しています。運動性は、これらの細胞の免疫機能の特異な側面である21,22,23,37,38、したがって、細胞の運動性におけるいかなる変化も、これらの細胞の免疫...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、イタリア大学研究省(CUP:F85D18000130001)がDiSTeBAに授与したプロジェクト「Dipartimento di Eccellenza」と、欧州連合NextGenerationEU(PNRR)が資金提供するNBFC(National Biodiversity Future Center)プロジェクトCN00000033の助成を受けて行われました。また、サレント大学の生物環境科学・技術学部のBIOforIUインフラストラクチャーにも感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

参考文献

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