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Resumen

El artículo propone un nuevo método in vitro para la evaluación rápida y sensible de la toxicidad y ecotoxicidad de contaminantes, basado en la motilidad de los hemocitos Mytilus galloprovincialis . El método tiene como objetivo contribuir al desarrollo de pruebas de exposición toxicológicas y ecotoxicológicas más éticas y sensibles.

Resumen

Los hemocitos son las células inmunocompetentes circulantes en los moluscos bivalvos y desempeñan un papel clave en varias funciones importantes de la inmunidad innata mediada por células. Durante las primeras etapas de la respuesta inmunitaria, los hemocitos migran activamente al sitio de la infección. Esta motilidad inherente es una característica fundamental de estas células. Representa una función celular clave que integra múltiples procesos, como la adhesión celular, la señalización celular, la dinámica del citoesqueleto y los cambios en el volumen celular. Por lo tanto, las alteraciones en la motilidad celular después de la exposición a fármacos o contaminantes pueden servir como un criterio de valoración toxicológico útil. A pesar del papel fundamental de la motilidad celular en la fisiología celular, ha sido poco investigada desde una perspectiva toxicológica. Este trabajo propone un nuevo método in vitro para la evaluación rápida y sensible de la toxicidad y ecotoxicidad de contaminantes, basado en la evaluación de la motilidad de los hemocitos de Mytilus galloprovincialis. Desarrollamos un ensayo de motilidad celular en hemocitos adheridos al fondo de una microplaca de poliestireno de 96 pocillos. Después de la exposición a concentraciones crecientes de fármacos, las trayectorias celulares y las velocidades se cuantificaron mediante el seguimiento celular bajo microscopía de lapso de tiempo, lo que nos permitió medir los efectos sobre la motilidad de los hemocitos. Debido a la facilidad de recolección de hemocitos de los animales de una manera relativamente no invasiva, el método propuesto ofrece una prueba alternativa para detectar los efectos y mecanismos de acción de contaminantes y medicamentos. Se alinea con los criterios de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento), abordando las preocupaciones éticas y contribuyendo a la reducción de las pruebas en animales in vivo con vertebrados.

Introducción

Los métodos basados en efectos, como los bioensayos in vitro e in vivo, representan herramientas innovadoras para la detección de los efectos de los contaminantes químicos ambientales en organismos vivos y para su uso como herramientas en el monitoreo ambiental y la evaluación de riesgos 1,2,3,4. Complementan el enfoque químico analítico clásico superando algunas de sus limitaciones. Por ejemplo, los métodos basados en efectos pueden evaluar la biodisponibilidad de los contaminantes, su impacto en la salud del organismo y los efectos toxicológicos combinados de las mezclas. Estos efectos combinados pueden no ser predecibles basándose únicamente en el análisis químico5.

En los últimos años, la ecotoxicología de los contaminantes de interés emergente (contaminantes emergentes) representa un campo en el que los métodos basados en efectos pueden ser herramientas útiles para detectar la exposición y evaluar el impacto en la biota 1,5,6,7. Varios métodos basados en el efecto utilizan moluscos bivalvos como organismos de ensayo en el seguimiento y la evaluación del medio ambiente 8,9. Algunas características hacen que estos organismos sean adecuados para estudios ecotoxicológicos, como su amplia distribución, su naturaleza de alimentación por filtración, su estilo de vida sésil, la capacidad de bioacumulación de una amplia gama de contaminantes ambientales y de desarrollar respuestas detectables a los contaminantes, la posibilidad de trabajar con diferentes etapas de vida y mantenerse en condiciones de laboratorio7. Son altamente sensibles a la exposición a la contaminación y muestran una variedad de respuestas a los contaminantes tóxicos dependiendo de la especie, la etapa de vida y las condiciones ambientales 8,9,10. Por lo tanto, varias guías ambientales utilizan especies de bivalvos como especies de prueba estandarizadas10,11.

Entre los moluscos bivalvos, el extendido Mytilus galloprovincialis es una de las especies más utilizadas en el campo ecotoxicológico debido a su capacidad para desarrollar respuestas tempranas detectables a la exposición a la contaminación química, incluyendo la inducción de metalotioneína, alteración de enzimas antioxidantes, desestabilización de la membrana lisosomal, peroxidación lipídica, acumulación de lipofuscina, aumento de la frecuencia de micronúcleos, inducción de anhidrasa carbónica 12,13,14, 15 de la Constitución. Los hemocitos, las células hemolinfáticas inmunocompetentes, son ampliamente utilizados para estudiar los impactos toxicológicos de los contaminantes ambientales en moluscos bivalvos 4,13,16,17. Estas células son cruciales para la respuesta inmunitaria del organismo, llevando a cabo varias funciones importantes de la inmunidad innata mediada por células. Estos incluyen la eliminación de microbios a través de la fagocitosis y diversas reacciones citotóxicas, como la liberación de enzimas lisosomales, péptidos antimicrobianos y la producción de metabolitos de oxígeno durante el estallido respiratorio 18,19,20. Los hemocitos son células intrínsecamente móviles 21,22,23 capaces de migrar al sitio de la infección durante la etapa temprana de la respuesta inmune del organismo. En general, la motilidad es una característica fundamental que caracteriza a todas las células inmunitarias, ya que permite la inmunovigilancia de estas células para proteger el organismo24. La investigación en varias especies de moluscos demuestra que la motilidad de los hemocitos es un componente crítico de su respuesta inmunitaria, la cicatrización de heridas y la interacción con patógenos. Esta motilidad está regulada por vías moleculares específicas, destacando la complejidad y especialización de las funciones de los hemocitos en los moluscos 21,25,26,27.

A pesar de la importancia fundamental de la motilidad en la fisiología de los hemocitos, muy pocos estudios han investigado la sensibilidad de la motilidad de los hemocitos a los contaminantes químicos ambientales 23,28,29,30. Recientemente, nuestro grupo caracterizó el movimiento espontáneo de hemocitos de Mytilus galloprovincialis en una microplaca de poliestireno de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos y examinó la sensibilidad de la motilidad de los hemocitos a la exposición in vitro al paracetamol23. Los hemocitos de M. galloprovincialis mostraron un movimiento celular aleatorio basado en lamelipodios y cambios rápidos de forma, como se encontró previamente en otra especie de mejillón, Mytilus edulis 21,22,23,28, y ya se describió en células inmunes humanas31. Recientemente se ha demostrado que la motilidad de los hemocitos es sensible a los estresores químicos23,28. Sobre la base de estos hallazgos previos, este trabajo propone un nuevo método in vitro para la evaluación rápida y sensible de la toxicidad y ecotoxicidad de contaminantes basado en la evaluación de la motilidad de los hemocitos de M. galloprovincialis y sus alteraciones, mediante el análisis velocimétrico de la motilidad celular (cuantificación de la velocidad media, la distancia migrada, la distancia euclidiana y la directa). El método ofrece la posibilidad de examinar in vitro la toxicidad de varias sustancias, ya sea en ensayos a corto plazo (que duran de 1 a 4 h) o ensayos de exposición prolongada, que duran entre 24 y 48 horas.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron bajo la legislación italiana de Bienestar Animal (D.L.26/2014) que implementó la Directiva del Consejo del Comité Europeo (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis es un bivalvo filtrador, comúnmente conocido como mejillón del Mediterráneo. Es originaria del mar Mediterráneo y de la costa atlántica del sur de Europa. Fue introducido y está muy extendido en el oeste de América del Norte, Asia y Sudáfrica. Es una especie pesquera comercial importante en varias partes del mundo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de agua de mar artificial (ASTM) o agua de mar natural filtrada

  1. Para la preparación de agua de mar artificial ASW según ASTM D1141-98 (2021)32, disuelva las siguientes sales en agua destilada (g para 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. La solución ASW tiene un pH de 7,80.
  2. Para la preparación de agua de mar natural filtrada (FSW), filtre el agua de mar natural 37 PSU, recolectada de un sitio no afectado por actividades antropogénicas con filtros de 0,2 μm.

2. Aclimatación de los animales

  1. Aclimatar especímenes adultos de mejillón (Mytilus galloprovincialis Lam.) durante 24 h en tanques estáticos (en inanición) que contengan ASW o FSW aireados (1 L/animal) a 15 °C en una sala termostática antes de su uso experimental.

3. Preparación de reactivos para la evaluación de la motilidad de los hemocitos

  1. Prepare agua de mar filtrada (FSW) como se indicó anteriormente o solución salina fisiológica estándar (SPS). Disuelva HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g en aproximadamente 800 mL de agua destilada, luego se compone hasta 1 L mediante la adición de más agua destilada. Ajuste el pH a 7,36 con 1 M de NaOH.
  2. Prepare una solución madre de rojo neutro de 20 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Prepare la solución de tinción de rojo neutro: Agregue 5 μL de una solución madre de rojo neutro a 995 μL de FSW o SPS.
  4. Prepare FSW o SPS suplementado con 2 mM de L-glutamina, 40 UI/mL de penicilina G y 100 μg/mL de estreptomicina de la siguiente manera: Agregue 100 μL de 2 mM de L-glutamina y 100 μL de mezcla de penicilina/estreptomicina a 10 mL de FSW/SPS.
  5. Preparar 0,4% de Trypan blue en FSW o SPS.
    NOTA: Se preparó una solución madre roja neutra de acuerdo con Martínez-Gómez et al.33. La solución madre de rojo neutro dura aproximadamente 2-3 semanas cuando se almacena a 4 °C. La solución de tinción de rojo neutro y el azul de tripano al 0,4% deben prepararse justo antes del ensayo.

4. Muestreo de hemolinfa

  1. Llene previamente una jeringa con 0,5 mL de agua de mar filtrada FSW o solución salina fisiológica estándar SPS (a 15 °C).
  2. Separe ligera y cuidadosamente las válvulas a lo largo de la superficie ventral con un bisturí. Mantenga el bisturí en su posición o utilice una punta de pipeta. Permita que la aguja de una jeringa hipodérmica entre el espacio entre las válvulas.
  3. Recoja suavemente 0,5 mL de hemolinfa del músculo aductor posterior con la jeringa precargada de acuerdo con UNEP/RAMOGE34.
  4. Retire la aguja de la jeringa y transfiera el contenido de la jeringa a un microtubo.
  5. Recoja la hemolinfa de 3-4 mejillones y agrupe las muestras de hemolinfa en un tubo a 15 °C utilizando la misma proporción entre individuos.
    NOTA: El prellenado de la jeringa se utiliza para diluir inmediatamente la hemolinfa 1:1 durante la toma de muestras. La dilución de la hemolinfa con FSW o SPS en una proporción de 50:50 es comúnmente utilizada para prevenir la agregación de hemocitos, según Martínez-Gómez et al.33.

5. Siembra y cultivo de hemocitos

  1. Cuente las células con un hemocitómetro.
  2. Diluir la hemolinfa a una concentración de 1 × 106 células/mL con FSW o SPS.
  3. Evaluar la viabilidad de los hemocitos en suspensión mediante tinción con azul de tripano: Añadir 100 μL de azul de tripano al 0,4% disuelto en FSW o SPS a 100 μL de suspensión de hemocitos. Incubar durante 5 min a 15 °C.
  4. A continuación, agregue una gota de suspensión en un hemocitómetro y cuente las células no teñidas (viables) y teñidas (no viables) bajo observación microscópica.
  5. Evaluar la viabilidad de los hemocitos como el porcentaje de células viables calculado sobre el número total de células contadas35.
  6. Utilice la siguiente fórmula para la evaluación de la viabilidad celular35:
    Células viables (%) = [número de células viables/número total de células (viables + no viables)] x 100
  7. Asegúrese de que la viabilidad de los hemocitos sea superior al 95% para avanzar en el protocolo.
  8. Añadir 50 μL de hemolinfa diluida en cada pocillo de una microplaca de poliestireno de fondo plano tratada con TC de 96 pocillos en cultivo celular. Cubra el plato con su tapa.
  9. Deje que los hemocitos se adhieran al fondo de los pocillos durante 30 minutos a 15 °C para formar una monocapa.
  10. Eliminar el exceso de hemolinfa aspirando suavemente con una micropipeta.

6. Ensayo a corto plazo

  1. Para ensayos a corto plazo (dentro de 1-4 h), incubar inmediatamente las células adheridas al fondo de los pocillos con 100 μL de la sustancia de interés disuelta en FSW o SPS a diferentes concentraciones a 15 °C. Utilice al menos tres pocillos para tres determinaciones repetidas de cada condición experimental.
  2. Después de la incubación, evalúe la motilidad celular siguiendo el paso 8.

7. Ensayo de exposición prolongada

  1. En el caso de exposiciones prolongadas, es decir, ensayos de exposición de 24 a 48 horas, incubar las células adherentes cultivadas con concentraciones crecientes de la sustancia problema disuelta en el medio de cultivo (FSW o ASW) suplementado con 2 mM de L-glutamina (40 UI/ml de penicilina G y 100 μg/ml de estreptomicina) a 15 °C. Utilice al menos tres pocillos para tres determinaciones repetidas de cada condición experimental.
  2. Después de la incubación, evalúe la motilidad celular siguiendo el paso 8.

8. Evaluación de la motilidad celular mediante microscopía time-lapse

  1. Inserte la placa de pocillos múltiples que contiene los hemocitos vivos adheridos en un lector multimodo.
  2. Evalúe la motilidad de las células vivas adherentes mediante imágenes en tiempo real en la placa a través de microscopía de lapso de tiempo: capture imágenes de la misma región de interés (ROI) (dimensión del ROI utilizada: 720 μm x 720 μm) en cada pocillo a una velocidad de 1 imagen cada 1 minuto durante 10 minutos utilizando el lector multimodo con un aumento de 20x y visualización de campo claro en color.
  3. Para una mejor visualización de los hemocitos, tiña las células con el colorante vital Rojo Neutro justo antes de la microscopía de lapso de tiempo de la siguiente manera:
    1. Retire el medio de incubación de cada pocillo.
    2. Añadir 100 μL de solución de tinción de rojo neutro disuelta en solución salina fisiológica estándar que contenga la sustancia de interés en los pocillos de la placa que contiene las células adherentes.
    3. Incubar las células a 15 °C durante 15 min. Lava el exceso de tinte.
    4. Añadir 100 μL de la sustancia de interés resuelta en FSW o SPS. Visualice las celdas para la evaluación de la motilidad.
      NOTA: El uso de un lector multimodo permite la adquisición simultánea de imágenes de un alto número de pocillos, permitiendo la detección simultánea de la motilidad de todas las condiciones experimentales y réplicas contenidas en el pozo. El colorante rojo neutro se retiene dentro de los lisosomas, que aparecen como pequeñas manchas anaranjadas en el citoplasma, mientras que el núcleo aparece como un agujero translúcido ya que el colorante vital acidófilo no lo tiñe. La adquisición de la imagen se realizó durante 10 min a una temperatura ambiente de 20 °C.

9. Seguimiento de células y cálculo de parámetros velocimétricos

  1. Analice los fotogramas de la misma región de interés adquiridos bajo microscopía de lapso de tiempo por la Imagen J para cada pocillo.
  2. Guarde las imágenes en una carpeta sin espacios en el nombre. Las imágenes pueden estar en formato JPEG o PNG.
  3. Abra ImageJ. Haga clic en Archivo > importar > secuencia de imágenes.
  4. Realice el seguimiento de celdas en celdas individuales mediante el complemento de seguimiento manual de ImageJ. Las posiciones de las celdas individuales se marcan en imágenes consecutivas, lo que permite el seguimiento de los cambios de posición a lo largo del tiempo.
  5. Analice al menos 40 celdas por pocillo, excluyendo las celdas que escapan del campo registrado del análisis.
  6. Importe conjuntos de datos desde el complemento de ImageJ, "Seguimiento manual", en el software Chemotaxis and Migration Tool, disponible gratuitamente.
  7. Cuantifique los parámetros velocimétricos, como la velocidad media, la distancia euclidiana, la distancia migrada y la directriz, utilizando el software Chemotaxis and Migration Tool de acuerdo con las instrucciones detalladas informadas en la guía del usuario disponible gratuitamente del software36o los pasos que se proporcionan a continuación:
    1. Importe conjuntos de datos desde el complemento "Seguimiento manual" de ImageJ al software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Seleccione el número deseado de cortes (por ejemplo, el número de imágenes utilizadas para el seguimiento).
    3. Calibra el software ajustando el tamaño de píxel x/y y el intervalo de tiempo. La calibración x/y indica la longitud del borde de un píxel en μm, mientras que el intervalo de tiempo representa la duración entre cada segmento.
    4. Después de ajustar los valores y parámetros, haga clic en Aplicar configuración.
    5. Traza trayectorias y exporta como imagen. Haga clic en el botón Valores medidos para ver los valores medidos. Guárdalo.
    6. Haga clic en el botón Estadísticas y guarde la velocidad y la dirección de la serie de pistas.
  8. Comparar los parámetros velocimétricos calculados para las células de control con los de los hemocitos expuestos a la sustancia problema a diferentes concentraciones.
    NOTA: La distancia migrada (medida en μm) se refiere a la longitud de la trayectoria de migración durante el período de observación (10 min). La distancia euclidiana (también medida en μm) representa la distancia en línea recta entre el punto inicial y el punto final de la celda. La velocidad media (expresada en μm min-1) se calcula como la relación entre la distancia migrada y la duración del seguimiento de cada célula. La franqueza se define como la relación entre la distancia euclidiana y la distancia acumulada para cada trayectoria.

Resultados

El estudio presenta un nuevo método in vitro para evaluar de forma rápida y sensible la toxicidad y ecotoxicidad de los contaminantes, utilizando la motilidad de los hemocitos Mytilus galloprovincialis. La Figura 1A-C muestra imágenes representativas de lapso de tiempo de los hemocitos después de 30 minutos de fijación al fondo del pocillo. Las células de la figura se tiñeron con rojo neutro justo an...

Discusión

El protocolo descrito en este trabajo representa un nuevo método in vitro adecuado para la evaluación rápida y sensible de la toxicidad de fármacos y contaminantes basado en la evaluación de la motilidad de los hemocitos de M. galloprovincialis y sus alteraciones. La motilidad es un aspecto peculiar de la función inmune de estas células 21,22,23,37,38, por lo que cualquier alteración en la motilidad celular puede presagiar alteraciones en la función inmune de e...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el proyecto "Dipartimento di Eccellenza" adjudicado a DiSTeBA por el Ministerio de Universidad e Investigación de Italia, CUP: F85D18000130001, y por NBFC (National Biodiversity Future Center) financiado por la Unión Europea NextGenerationEU, PNRR, proyecto n. CN00000033. También agradecemos la infraestructura de BIOforIU en el Departamento de Ciencias y Tecnologías Biológicas y Ambientales de la Universidad de Salento.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

Referencias

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