利用 MicroRNA 货物在新鲜冷冻人脑切片释放的小细胞外囊泡中的力量

摘要

在这里，我们使用最少量的新鲜冷冻脑组织切片和可访问的高速离心方法结合尺寸排阻色谱法建立了一个方案，以获得小的细胞外囊泡作为神经系统疾病的 microRNA （miRNA） 生物标志物的来源。

摘要

小细胞外囊泡 （sEV） 是细胞间通讯的重要介质，运输蛋白质、脂质和核酸（microRNA、mRNA、DNA）等多种物质。由于 sEV 能够穿过生物屏障（例如血脑屏障）并通过各种体液进入，因此 microRNA sEV 货物具有作为强大的非侵入性疾病生物标志物的潜在用途。尽管对体液中的 sEV 生物标志物进行了大量研究，但识别组织或细胞特异性 sEV 亚群仍然具有挑战性，尤其是来自大脑的亚群。我们的研究通过调整现有方法，使用尺寸排阻色谱 （SEC） 从最少量的冷冻人脑切片中分离 sEVs 来应对这一挑战。

经伦理批准后，从 3 个供体组织中切片约 250 μg 新鲜冷冻人脑组织（从曼彻斯特脑库 [英国] 获得），并在 3 型胶原酶/冬眠-E 溶液中孵育，中间搅拌，然后进行连续离心和过滤步骤。然后，使用 SEC 方法分离 sEVs，并遵循 MISEV 指南进行表征。从这些 sEV 中分离 RNA 之前，用蛋白酶-K 和 RNase-A 处理溶液，以去除任何非 sEV 细胞外 RNA。检查 RNA 数量和质量并进一步处理以进行 qPCR 和小 RNA 测序实验。

通过荧光纳米颗粒示踪分析 （fNTA） 和表面标志物 （CD9 、 CD63 、 CD81 ） 的蛋白质印迹证实 sEVs 的存在。尺寸分布 （50-200 nm） 通过 NTA 和电子显微镜确认。裂解的 sEVs 中的总 RNA 浓度范围为 3-9 ng/μL，用于通过 qPCR 成功定量选定的候选 microRNA。在MiSeq上进行小RNA测序可提供高质量的数据（Q >32），每个样本有1.4-500万个reads。

该方法能够从最小的脑组织体积中有效地分离和表征 sEV，促进非侵入性生物标志物研究，并为公平的疾病生物标志物研究带来希望，为神经退行性疾病和潜在的其他疾病提供见解。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是所有多细胞生物中细胞间通讯的关键参与者之一¹。EV 是细胞来源的脂质双层膜颗粒，可促进各种货物负荷（如蛋白质、脂质和核酸）转移到受体细胞。EV 的尺寸范围很广，从 30 nm 到 1 μM。小 EV （sEV），定义为平均直径为 <200 nm 的脂质结合囊泡，具有穿过血脑屏障的能力;因此，它们与神经退行性疾病和其他病症（如阿尔茨海默病 （AD）、额颞叶痴呆 （FTD）、帕金森病 （PD） 和癌症 ^2,3 的朊病毒样传播和恶化有关。此外，由于 sEV 存在于血液、脑脊液 （CSF）、唾液甚至尿液等一系列生物流体中，因此它们的有益用途可以跨越生物标志物和非侵入性诊断领域。例如，AD 研究可能指出使用生物流体致病蛋白比率，例如 tau/Aβ，甚至 Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴。

一种已知的 sEV 货物是 microRNA （miRNA），这是一组长度约为 22 个核苷酸的小非编码 RNA 分子，与 mRNA 的 3'-UTR 区域结合，通常负向调节蛋白质表达。miRNA 参与许多细胞作用，还与各种疾病的发病机制有关，包括癌症和神经退行性疾病。Cheng 等人对 AD 患者血清衍生的 sEV miRNA 表达特征进行了高通量测序分析⁵。一旦结合神经影像学记录和年龄、性别和 APOE ε4 等位基因呈递的已知危险因素，结果发现预测 AD 的敏感性为 87%，特异性为 77%。此外，研究已经确定了两种上调的 CSF miRNA （miR-151a-3p、let-7f-5p） 和 3 种下调的 miRNA （miR-27a-3p、miR-125a-5p 和 miR-423-5p），它们可能诊断早期 PD⁶。对于病理性疾病，病理状态可能先于疾病的某些特征性症状，而在神经退行性变中，病理特征的积累比认知能力下降早得多。

MicroRNA 可能是一种比蛋白质更有效的生物标志物，因为它们具有多种功能和更高阶的表观遗传调控。使用脑组织，研究人员可以潜在地识别疾病及其亚型的特定脑源性 sEV （BDsEV） miRNA 特征。例如，具有神经元和神经胶质标志物的 sEV 可以呈现不同的 miRNA 货物，并且分析可以产生更精确的疾病检测方法。此外，BDsEVs 被认为在神经致病蛋白的跨突触扩散中起重要作用⁷。以前的报告建议免疫沉淀和密度梯度（蔗糖梯度）超速离心从新鲜冷冻的脑组织中获得^sEVs8,9。然而，这些方法需要特定的基础设施，包括超速离心机和下游纯化方法，以获得高质量的 sEV 样品¹⁰。最近的报告建议对该方法进行一些修改^{和改进 11,12,13};然而，尽管如此，从人体组织中分离和研究 sEV 衍生的 microRNA 仍未得到广泛应用。本协议中描述的方法旨在为脑源性 sEV 研究提供精细的分步协议，以提高该技术的可及性。我们建立了一个使用最少量脑组织的方案，我们使用尺寸排阻色谱从中分离出纯 sEV，并显示来自这些 sEV 的 microRNA 货物的高质量下一代测序数据。

研究方案

这项工作已获得曼彻斯特脑库（REC 参考 09/H0906/52）和索尔福德大学伦理委员会（申请 ID:3408）的道德批准。

1. 在冷冻脑组织切片上使用胶原酶分解细胞内基质

1. 使用消毒手术刀在冷板上将 250 mg 冷冻脑组织（约 0.4 mm 厚的碎片）切成薄片，并加入 2 mL 75 U/mL III/Hibernate-E 型胶原酶溶液。
2. 将每个样品在 37 °C 的水浴中孵育 20 分钟。在 5 分钟时，将每个样品倒置两次以混合;在 10 分钟时，使用 10 mL 塑料一次性条纹轻轻移液每个样品 3 次。
3. 将每个样品置于冰上，加入 1x 蛋白酶抑制剂混合物和 1x 磷酸酶抑制剂。这会停止酶反应，并且是使用 III 型胶原酶消化的终点。
4. 将每个脑组织样品在 4 °C 下以 300x g 离心 10 分钟。 收集每个上清液，并在 4 °C 下以 2000 x g 进一步离心 15 分钟。
5. 再次收集每个上清液并通过 0.22 μm 过滤器过滤。将每个滤液在 4 °C 下以 10 000 x g 离心 48 分钟。
6. 收集上清液，并以 2:1 的比例向每个样品中加入沉淀缓冲液。在 4 °C 下孵育过夜。
7. 在 4 °C 下以 10 000 x g 的速度离心每个样品 96 分钟，然后将沉淀重悬于 100 μL 不含细胞外囊泡 （EV） 的 PBS 中。

2. 体积排阻色谱柱的制备

1. 使用前，将预制的 SEC 色谱柱在室温 （RT） 下平衡 15 分钟。
   注意: 必须先取下底盖，然后再拧上螺帽。
2. 平衡后，从色谱柱顶部去除防腐剂缓冲液，并使用 250 μL 不含 EV 的 PBS 洗涤色谱柱两次。每个 PBS 洗涤液都通过重力进入色谱柱。

3. 使用尺寸排阻色谱分离细胞外小囊泡

1. 将重悬的沉淀添加到 SEC 色谱柱的顶部，并以 50 x g 的速度离心色谱柱 30 秒。丢弃流出物。
2. 将 180 μL 不含 EV 的 PBS 添加到 SEC 色谱柱顶部，并以 50 x g 的速度离心色谱柱 1 分钟，让脑源性 sEV 从色谱柱中洗脱。
   注意: 图 1 总结了上面详述的协议部分。

4. 通过 western blotting 确认小的细胞外囊泡标志物

1. 为了在蛋白质印迹分析之前裂解 sEV（以确保分析所有膜和胞质货物），在裂解和提取缓冲液（1x 蛋白酶抑制剂和 1x 磷酸酶抑制剂）中以 1:1 稀释分离的 sEV 样品。
2. 在 4 °C 下搅拌样品 30 分钟。
3. 将样品以 14 000 x g 离心 15 分钟。
4. 收集蛋白质上清液并使用蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。
5. 将样品与 4x Laemmli 缓冲液混合，并将 20 μg 蛋白质加载到每个孔中，靠着预染色的蛋白质分子量标准。
6. 分离后，将蛋白质转移到 0.45 μm 硝酸纤维素膜上。转移后，在 5% BSA 中封闭膜 2 小时。
7. 将膜与一抗（表 1）孵育过夜。
8. 用洗涤缓冲液（PBS 中的 1% Tween20）洗涤膜 3 次，并使用抗小鼠二抗染色。之后，用洗涤缓冲液（PBS 中的 1% Tween20）洗涤 3 次。
9. 在对印迹进行成像之前，请按照手稿中的上述步骤进行作。
10. 使用辣根过氧化物酶 （HRP） 底物进行成像。

5. 通过纳米颗粒示踪分析 （NTA） 确认小的细胞外囊泡

1. 执行 NTA 以分析样品中所有颗粒的浓度和大小。通过在 PBS 中以 1:1000 的稀释因子稀释每个样品来执行此作。
2. 将样品注入 NTA 仪器中，并在 550 nm 的波长下读取样品。在此阶段，按照 MISEV 指南中的建议，使用颗粒数量测量每颗粒的蛋白质量（通常以飞克表示）。
3. 接下来，对于荧光 NTA，在 PBS 中以 1:1000 的稀释因子稀释细胞掩膜橙 （CMO）（染色样品中的所有生物颗粒）。由此，使用 sEV 样品以 1:10 的稀释因子稀释 CMO 染料 - 在 4 °C 下在黑暗中孵育该稀释步骤 30 分钟。
4. 使用 PBS 以 1:1000 的稀释倍数稀释第二种 CMO 稀释液。
   注意:CMO 染料的最终稀释度必须为 1:10 000 000。
5. 使用 NTA 仪器在 550 nm 波长下读取每个 sEV 样品的 CMO。
6. 对于跨膜四蛋白荧光抗体（参见 材料表），首先，在 PBS 中以 1:10 的稀释倍数稀释每种抗体。由此，使用 sEV 样品以 1:10 的稀释因子稀释每种染料 - 在 4 °C 下在黑暗中孵育稀释步骤 2 小时。
7. 使用 PBS 以 1:1000 的稀释倍数稀释第二抗体。
   注:每种 tetraspanin 抗体的最终稀释度必须为 1:100 000。
8. 使用 NTA 仪器在 550 nm 波长下读取 sEV 样品的荧光抗体读数。

6. 通过透射电子显微镜 （TEM） 确认小的细胞外囊泡

注意:该协议由利物浦大学的生物医学显微镜设施执行。

1. 首先，使用戊二醛固定 sEV 样品并使用乙酸铀酰染色。
2. 通过一系列分级醇类，对样品进行脱水，以备进行 TEM。
3. 使用合适的透射电子显微镜对样品进行成像。

7. 蛋白酶 K 和 RNase A 处理

1. 向 50 μL 分离的脑源性 EVs 中加入 1 μL 20 μg/μL 蛋白酶 K，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
2. 通过加入 1x 蛋白酶抑制剂混合物终止每个反应，并在冰上孵育 10 分钟。
3. 孵育后，向每个样品中加入 1 μL 10 μg/μL RNase A，并在 37 °C 下进一步孵育 30 分钟。
   注意:立即转到第 8 部分。

8. 从细胞外小囊泡中分离总 RNA

1. 要分离总 RNA，请将 700 μL 高质量 RNA 回收裂解试剂添加到 50 μL 脑源性 EV （BDsEV） 样品中。搅拌每个样品 1 小时。
2. 加入 140 μL 氯仿，剧烈摇晃每个样品 20 秒，然后在 RT 下孵育 3 分钟。
3. 将样品在 4 °C 下以 12 000 x g 离心 15 分钟，并从样品中收集界面。加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇。
4. 加入 700 μL 间/乙醇混合物 RNA 分离柱，并在室温下以 ≥8000 x g 离心 15 秒。
   注:使用所有界面/乙醇样品重复此步骤。
5. 向色谱柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液，并以 ≥8000 x g 离心 15 秒。丢弃流出物。
6. 加入 500 μL 缓冲液 RPE，然后再次以 ≥8000 x g 离心 15 秒。丢弃流出物。
7. 加入 500 μL 80% 乙醇，并以 ≥8000 x g 离心 2 分钟。丢弃流出物。
8. 此时，打开盖子，以全速 （>8000 x g） 离心色谱柱 5 分钟，干燥柱膜。
9. 将色谱柱转移到新的收集管中，直接向柱膜中加入 14 μL 不含 RNase 的水，并以 ≥8000 x g 离心 1 分钟以从 BDsEVs 中洗脱总 RNA。
10. 使用 miRNA 定量检测试剂盒对样品中的总 microRNA 进行定量，其中样品在定量荧光计上测量，选择 miRNA 检测类型。

9. 小 RNA 测序

1. 定量样品中的 miRNA 后，使用 Small RNA-Seq 文库制备试剂盒合成 cDNA 文库。
   注:使用该方案，文库生成包括四个步骤:3' 接头连接、纯化、5' 接头连接和逆转录 - 最后形成 RNA/cDNA 文库。文库生成后，终点 PCR 扩增与添加索引引物（用于多重目的）一起发生，然后纯化样品。
2. 为了检测 RNA 质量，使用质量控制应用分析，详细说明每种制剂的大小和峰强度。
3. 要检测 DNA 浓度，请在定量荧光计上测量 DNA 定量，选择 dsDNA 检测类型。
4. 使用试剂盒制备用于小 RNA Seq 的样品，然后将样品加载到流通池中。

结果

为了确认 BDsEVs 的存在，使用了三种技术:western blotting、NTA 和 TEM（图 3）。蛋白质印迹结果（图 3A 和 补充文件 1）显示存在所有五个阳性标志物（CD9、CD63、CD81、Flot-1 和 TSG101）并且 sEV 中不存在钙联蛋白（用作阴性对照），证实没有细胞内容物污染。正如预期的那样，对于测试的标志物，脑匀浆 （BH） 显示的蛋白...

讨论

这种用于分离脑源性小细胞外囊泡及其 microRNA 货物的修改和改进方案证明了在不影响下游产品质量和数量的情况下使用最少组织的可行性。在生物标志物发现领域，识别特定于细胞和组织类型的分子标识符可以带来更易于使用的使用体液的无创诊断测试方法。此外，此处描述的方法为识别不同细胞类型（神经元与神经胶质细胞）、组织类型（海马组织与前额叶皮层组织?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094