新鮮凍結ヒト脳切片から放出される小さな細胞外小胞におけるマイクロRNAカーゴの力の利用

要約

ここでは、神経疾患のマイクロRNA(miRNA)バイオマーカーの供給源として、最小限の新鮮凍結脳組織切片と利用可能な高速遠心分離法、およびサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせたプロトコルを確立します。

要約

細胞外小胞(sEV)は、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターであり、タンパク質、脂質、核酸(マイクロRNA、mRNA、DNA)などの多様なカーゴを輸送します。マイクロRNAのsEVカーゴは、生物学的障壁(血液脳関門など)を通過し、さまざまな体液を通じてアクセスできるようになる能力があるため、強力な非侵襲的疾患バイオマーカーとして有用性が期待されています。体液中のsEVバイオマーカーに関する数多くの研究にもかかわらず、特に脳から組織または細胞特異的なsEV亜集団を特定することは依然として困難です。私たちの研究では、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して、凍結したヒト脳切片の最小量からsEVを分離する既存の方法を適応させることで、この課題に対処します。

倫理的承認後、約250 μgの新鮮凍結ヒト脳組織(Manchester Brain Bank[英国]から取得)を3つのドナー組織からスライスし、コラゲナーゼ3型/Hibernate-E溶液でインキュベートし、中間攪拌を行い、その後、遠心分離とろ過ステップを連続して行いました。次に、SEC法を用いてsEVを分離し、MISEVガイドラインに従って特徴付けました。これらのsEV内からRNAを単離する前に、溶液をProteinase-KおよびRNase-Aで処理して、非sEV細胞外RNAを除去しました。RNAの量と質は、qPCRおよびsmall RNAシーケンシング実験のためにさらにチェックされ、処理されます。

sEVの存在は、蛍光ナノ粒子追跡分析(fNTA)および表面マーカー(CD9、CD63、CD81)のウェスタンブロットによって確認されました。サイズ分布(50-200 nm)は、NTAおよび電子顕微鏡法により確認されました。溶解したsEV内の総RNA濃度は3〜9 ng/μLの範囲であり、選択した候補microRNAのqPCRによる定量に成功しました。MiSeqでのsmall RNAシーケンシングは、サンプルあたり140万〜500万リードの高品質データ(Q >32)を提供しました。

この方法は、最小限の脳組織容積からsEVを効率的に分離し、特性評価することを可能にし、非侵襲的なバイオマーカー研究を促進し、公平な疾患バイオマーカー研究を有望視し、神経変性疾患やその他の障害に関する洞察を提供します。

概要

細胞外小胞(EV)は、すべての多細胞生物における細胞間コミュニケーションの主要なプレーヤーの^1つです1。EVは、タンパク質、脂質、核酸などのさまざまなカーゴロードのレシピエント細胞への移動を促進できる細胞由来の脂質二重膜粒子です。小型EV(sEV)は、平均直径サイズが<200nmの脂質結合小胞と定義され、血液脳関門を通過する能力を持っています。したがって、彼らは、神経変性疾患やアルツハイマー病(AD)、前頭側頭型認知症(FTD)、パーキンソン病(PD)、癌などの他の状態のプリオン様の広がりと悪化に関与しています^2,3。さらに、sEVは血液、脳脊髄液(CSF)、唾液、さらには尿など、さまざまな生体液に見られるため、バイオマーカーや非侵襲的診断の分野にも有効活用できます。例えば、ADの研究では、タウ/Aβ、さらにはAβ42/_Aβ40⁴などの生体流体病原性タンパク質比の使用が指摘されている場合があります。

sEVの既知のカーゴの1つはマイクロRNA(miRNA)であり、これは長さが約22ヌクレオチドの小さなノンコーディングRNA分子のグループで、mRNAの3'-UTR領域に結合し、通常はタンパク質発現を負に調節します。miRNAは、多くの細胞の役割に関与しており、がんや神経変性疾患など、さまざまな疾患の病因にも関与しています。Chengらは、AD患者からの血清由来sEV miRNA発現シグネチャーのハイスループットシーケンシング解析を実施しました⁵。神経画像記録と年齢、性別、APOE ε4対立遺伝子の提示の既知の危険因子と組み合わせると、結果は87%の感度と77%の特異度でADを予測することがわかりました。さらに、研究により、初期段階の PD⁶ を診断できる可能性のある 2 つのアップレギュレーションされた CSF miRNA(miR-151a-3p、let-7f-5p)と 3 つのダウンレギュレーションされた miRNA(miR-27a-3p、miR-125a-5p、miR-423-5p)が特定されました。病理学的疾患では、病理学的状態が疾患の特定の特徴的な症状に先行する可能性がありますが、神経変性では、病理学的特徴の蓄積は認知機能低下よりもはるかに早く発生します。

マイクロRNAは、その多様な機能と高次のエピジェネティックな制御により、タンパク質よりも効果的なバイオマーカーとなる可能性があります。脳組織を用いることで、研究者は疾患とそのサブタイプに対する特定の脳由来sEV(BDsEV)miRNAシグネチャーを特定できる可能性があります。例えば、ニューロンマーカーとグリアマーカーを持つsEVは、異なるmiRNAカーゴを示す可能性があり、その分析により、より正確な疾患検出方法が可能となります。さらに、BDsEVは神経病原性タンパク質のトランスシナプス拡散に大きな役割を果たし^{ていることが示唆}されている7。以前の報告では、新鮮凍結^{脳組織から}sEVを得るための免疫沈降および密度勾配(ショ糖勾配)超遠心分離が提案されている^8,9。ただし、これらのアプローチでは、高品質のsEVサンプルを取得するために、超遠心分離機およびダウンストリーム精製方法を備えた特定のインフラストラクチャが必要です¹⁰。より最近の報告では、アプローチ11,12,13に対するいくつかの変更と改善が提案されています。しかし、それにもかかわらず、ヒト組織からのsEV由来マイクロRNAの単離と研究はまだ広く適用されていません。このプロトコルで説明されているアプローチは、この技術へのアクセス性を高めるために、脳由来の sEV 研究のための洗練された段階的なプロトコルを提供することを目的としています。最小限の脳組織を用いてプロトコルを確立し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて純粋なsEVを単離し、これらのsEVのマイクロRNAカーゴから高品質な次世代シーケンシングデータを示しました。

プロトコル

この研究は、マンチェスター・ブレイン・バンク(REC reference 09/H0906/52)およびサルフォード大学の倫理委員会(アプリケーションID:3408)によって倫理的に承認されています。

1. コラゲナーゼを用いた凍結脳組織切片上の細胞内マトリックスの解析

1. 凍結脳組織250 mg(厚さ約0.4 mmの断片)を滅菌メスでコールドプレートに薄くスライスし、75 U/mLコラゲナーゼIII型/冬眠E溶液2 mLを加えます。
2. 各サンプルを37°Cのウォーターバスで20分間インキュベートします。5分ポイントで、各サンプルを2回反転させて混合します。10分経過時に、10 mLのプラスチック製ディスポーザブルストリケットを使用して、各サンプルを3回穏やかにピペットで撒きます。
3. 各サンプルを氷上に置き、1x Protease inhibitorカクテルと1x phosphatase inhibitorを加えます。これにより酵素反応が停止し、コラゲナーゼIII型を用いた消化の終点となります。
4. 各脳組織サンプルを300x g で4°Cで10分間遠心分離します。 各上清を回収し、さらに2000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
5. 各上清を再度収集し、0.22 μmフィルターでろ過します。各濾液を10,000 x g で48分間、4°Cで遠心分離します。
6. 上清を採取し、各サンプルに2:1の比率で沈殿バッファーを添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
7. 各サンプルを10,000 x g で96分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを100 μLの細胞外小胞(EV)遊離PBSに再懸濁します。

2. サイズ排除クロマトグラフィーカラムの調製

1. 使用前に、あらかじめ調製したSECカラムを室温(RT)で15分間平衡化します。
   注意: ネジキャップの前にボトムキャップを取り外す必要があります。
2. 平衡化後、カラムの上部から保存剤バッファーを取り出し、250 μL の EV フリー PBS を使用してカラムを 2 回洗浄します。各PBS洗浄は、重力によってカラムに入るように放置されます。

3. サイズ排除クロマトグラフィーを用いた小さな細胞外小胞の単離

1. 再懸濁したペレットをSECカラムの上部に加え、カラムを50 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
2. 180 μL の EV フリー PBS を SEC カラムの上部に加え、カラムを 50 x g で 1 分間遠心分離して、脳由来の sEV をカラムから溶出させます。
   注:上記のプロトコルの一部を 図1にまとめます。

4. ウェスタンブロッティングによる微小細胞外小胞マーカーの確認

1. ウェスタンブロット解析の前にsEVを溶解するには(すべての膜および細胞質カーゴが解析されるようにするため)、単離したsEVサンプルを溶解および抽出バッファー(1xプロテアーゼ阻害剤および1xホスファターゼ阻害剤)で1:1に希釈します。
2. サンプルを4°Cで30分間撹拌します。
3. サンプルを14,000 x g で15分間遠心分離します。
4. タンパク質上清を採取し、タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。
5. サンプルを4x Laemmli bufferと混合し、20 μgのタンパク質を事前に染色したタンパク質ラダーに対して各ウェルにロードします。
6. 分離したら、タンパク質を0.45 μmのニトロセルロースメンブレンに移します。転写後、メンブレンを5%BSAで2時間ブロッキングします。
7. メンブレンを一次抗体(表1)と一晩インキュベートします。
8. メンブレンを洗浄バッファー(PBS中の1% Tween20)で3回洗浄し、抗マウス二次抗体を用いて染色します。その後、洗浄バッファー(PBS中の1% Tween20)で3回洗浄します。
9. ドロットをイメージングする前に、原稿の上記の手順に従ってください。
10. 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)基質を使用した画像。

5. ナノ粒子トラッキング解析(NTA)による細胞外微小小胞の確認

1. NTAを実行して、サンプル内のすべての粒子の濃度とサイズを分析します。これを行うには、各サンプルをPBSで1:1000の希釈係数で希釈します。
2. サンプルをNTA装置に注入し、550nmの波長でサンプルを読み取ります。この段階では、MISEVガイドラインで推奨されているように、粒子量を使用して、粒子あたりのタンパク質の量(通常はフェムトグラムで表されます)を測定します。
3. 次に、蛍光NTAの場合、PBS中のセルマスクオレンジ(CMO)(サンプル中のすべての生体粒子を染色)を1:1000の希釈係数で希釈します。これから、sEVサンプルを使用してCMO色素を1:10の希釈係数で希釈します - この希釈ステップを暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
4. PBSを使用して2回目のCMO希釈を1:1000の希釈係数で希釈します。
   注:CMO色素の最終希釈率は1:10 000 000でなければなりません。
5. NTA装置を使用して、波長550nmで各sEVサンプルのCMOを読み取ります。
6. テトラスパニン蛍光抗体( 材料表を参照)については、まず、PBS中の各抗体を1:10の希釈係数で希釈します。これから、sEVサンプルを使用して各色素を1:10の希釈係数で希釈します - 希釈ステップを暗所で4°Cで2時間インキュベートします。
7. PBSを使用して2回目の抗体希釈を1:1000の希釈係数で希釈します。
   注:各テトラスパニン抗体の最終希釈率は1:100 000でなければなりません。
8. NTA装置を使用して、波長550 nmのsEVサンプルの蛍光抗体測定値を読み取ります。

6. 透過型電子顕微鏡(TEM)による細胞外微小小胞の確認

注:このプロトコルは、リバプール大学の生物医学顕微鏡施設によって実施されました。

1. まず、グルタルアルデヒドを用いてsEV試料を固定し、酢酸ウラニルを用いて染色します。
2. 等級付けされた一連のアルコールを通じて、TEMの準備が整ったサンプルを脱水します。
3. 適切な透過型電子顕微鏡を使用した画像サンプル。

7. プロテイナーゼKおよびRNase A治療

1. 単離された脳由来のEV50 μLに、20 μg/μLのプロテイナーゼKを1 μL加え、37°Cで30分間インキュベートします。
2. 1x プロテイナーゼ阻害剤カクテルを添加して各反応を停止し、氷上で10分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、10 μg/μL RNase Aを1 μLずつ各サンプルに加え、さらに37°Cで30分間インキュベートします。
   注:すぐにセクション8に進んでください。

8. 細胞外小胞からのトータルRNAの単離

1. トータルRNAを単離するには、700 μLの高品質RNA回収溶解試薬を50 μLの脳由来EV(BDsEV)サンプルに加えます。各サンプルを1時間撹拌します。
2. 140 μLのクロロホルムを加え、各サンプルを20秒間激しく振とうし、室温で3分間インキュベートします。
3. サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、サンプルから間相を収集します。100%エタノールの1.5倍容量を追加します。
4. 700 μLの相間/エタノール混合物RNA単離カラムを添加し、≥8000 x g でRTで15秒間遠心分離します。
   注:すべての相間/エタノールサンプルを使用してこの手順を繰り返します。
5. カラムに700 μLの洗浄バッファーを加え、≥8000 x g で15秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
6. 500 μL のバッファー RPE を添加し、再度 ≥8000 x g で 15 秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
7. 80%エタノール500μLを加え、≥8000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
8. この時点で、蓋を開けた状態でカラムを全速力(>8000 x g)で5分間遠心分離し、カラムメンブレンを乾燥させます。
9. カラムを新しいコレクションチューブに移し、14 μL の RNase フリー水を直接カラムメンブレンに加え、≥8000 x g で 1 分間遠心分離して、BDsEV からトータル RNA を溶出します。
10. miRNA 定量アッセイキットを使用して、サンプルを含む全 microRNA を定量し、サンプルを定量蛍光光度計で測定し、miRNA アッセイタイプを選択します。

9. small RNAシーケンシング

1. サンプル中のmiRNAを定量した後、Small RNA-Seq Library Prep Kitを使用してcDNAライブラリーを合成します。
   注:このプロトコルを使用して、ライブラリ生成には、3'アダプターライゲーション、精製、5'アダプターライゲーション、および逆転写(最終的にRNA/cDNAライブラリが形成される)の4つのステップが含まれていました。ライブラリ生成後、インデックスプライマーを添加してエンドポイントPCR増幅を行い(マルチプレックス化に使用)、その後、サンプルを精製します。
2. RNAの品質をテストするには、各調製物のサイズとピーク強度を詳述した品質管理アプリケーションアッセイを使用します。
3. DNA濃度を試験するには、定量蛍光光度計でDNA定量を測定し、dsDNAアッセイタイプを選択します。
4. 試薬キットを使用してSmall RNA Seq用のサンプルを調製し、その後、サンプルをフローセルにロードします。

結果

BDsEVの存在を確認するために、ウェスタンブロッティング、NTA、TEMの3つの手法を利用しました(図3)。ウェスタンブロットの結果(図3A および 補足ファイル1)は、5つの陽性マーカー(CD9、CD63、CD81、Flot-1、およびTSG101)すべての存在と、sEVにおけるカルネキシンの不在(ネガティブコントロールとして使用)を示して?...

ディスカッション

脳由来の小さな細胞外小胞とそのマイクロRNAカーゴを単離するためのこの改良および改良されたプロトコルは、下流の製品の品質と量を損なうことなく、最小限の組織を使用することの実現可能性を示しています。バイオマーカー探索の分野では、細胞や組織の種類に特異的な分子識別子を同定することで、体液を用いた非侵襲的な診断検査をより身近な手段にする...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094