Использование возможностей микроРНК в небольших внеклеточных везикулах, высвобождаемых из свежезамороженных участков мозга человека

Резюме

В данной работе мы разрабатываем протокол с использованием минимального количества свежезамороженных срезов мозговой ткани и доступного высокоскоростного метода центрифугирования в сочетании с эксклюзионной хроматографией для получения небольших внеклеточных везикул в качестве источников микроРНК (микроРНК) биомаркеров неврологических расстройств.

Аннотация

Малые внеклеточные везикулы (sEVs) являются важнейшими медиаторами межклеточной коммуникации, транспортируя различные грузы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты (микроРНК, мРНК, ДНК). Груз микроРНК sEV имеет потенциальную полезность в качестве мощного неинвазивного биомаркера заболевания благодаря способности sEV преодолевать биологические барьеры (например, гематоэнцефалический барьер) и становиться доступным через различные жидкости организма. Несмотря на многочисленные исследования биомаркеров sEV в жидкостях организма, идентификация тканевых или клеточно-специфических субпопуляций sEV остается сложной задачей, особенно в мозге. Наше исследование решает эту проблему путем адаптации существующих методов выделения sEV из минимального количества замороженных участков мозга человека с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).

После этического одобрения около 250 г свежезамороженной ткани человеческого мозга (полученной из Манчестерского банка мозга [Великобритания]) были срезаны из трех донорских тканей и инкубированы в растворе коллагеназы типа 3/Hibernate-E с промежуточным перемешиванием, за которым последовали этапы центрифугирования и фильтрации. Затем sEV были выделены с использованием метода SEC и характеризовались следованием рекомендациям MISEV. Перед выделением РНК из этих sEV раствор обрабатывали Proteinase-K и RNase-A для удаления любых внеклеточных РНК, не относящихся к sEV. Количество и качество РНК проверяли и обрабатывали для экспериментов по количественной ПЦР и секвенированию малых РНК.

Присутствие sEVs было подтверждено с помощью флуоресцентного анализа наночастиц (fNTA) и вестерн-блоттинга для поверхностных маркеров (CD9, CD63, CD81). Распределение по размерам (50-200 нм) было подтверждено методами NTA и электронной микроскопии. Общая концентрация РНК в лизированных sEV варьировалась от 3 до 9 нг/мкл и использовалась для успешного количественного определения с помощью количественной ПЦР для выбранных потенциальных микроРНК. Секвенирование малых РНК на MiSeq дало данные высокого качества (Q >32) с 1,4-5 миллионами прочтений на образец.

Этот метод позволяет эффективно выделять и характеризовать sEVs из минимальных объемов ткани мозга, облегчая неинвазивные исследования биомаркеров и обещая справедливые исследования биомаркеров заболеваний, предлагая понимание нейродегенеративных заболеваний и потенциально других расстройств.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) являются одним из ключевых игроков в межклеточной коммуникации у всех многоклеточных организмов¹. ВВ представляют собой липидные двухслойные мембранные частицы клеточного происхождения, которые могут способствовать переносу различных грузовых нагрузок, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, к клеткам-реципиентам. ВВ могут иметь широкий диапазон размеров в диапазоне от 30 нм до 1 мкм. Малые ВВ (sEV), определяемые как связанные с липидами везикулы со средним диаметром <200 нм, обладают способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер; следовательно, они были вовлечены в прионоподобное распространение и обострение нейродегенеративных заболеваний и других состояний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), лобно-височная деменция (ЛВД), болезнь Паркинсона (БП) и рак ^2,3. Кроме того, поскольку sEV можно найти в ряде биожидкостей, таких как кровь, спинномозговая жидкость (СМЖ), слюна и даже моча, их полезное использование может охватывать область биомаркеров и неинвазивной диагностики. Например, исследования болезни Альцгеймера могут указывать на использование соотношений патогенных белков биожидкости, таких как тау/Aβ или даже Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴.

Одним из известных грузов sEV является микроРНК (miRNA), группа небольших некодирующих молекул РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые связываются с 3'-UTR-областями мРНК и обычно негативно регулируют экспрессию белков. Участвующие во многих клеточных ролях, микроРНК также участвуют в патогенезе различных заболеваний, включая рак и нейродегенеративные заболевания. Cheng et al. провели высокопроизводительный анализ секвенирования сигнатур экспрессии микроРНК sEV, полученных из сыворотки крови, у пациентов с болезнью Альцгеймера⁵. В сочетании с данными нейровизуализации и известными факторами риска возраста, пола и проявления аллеля APOE ε4 было обнаружено, что результаты предсказывают болезнь Альцгеймера с 87% чувствительностью и 77% специфичностью. Кроме того, исследования выявили две повышенные микроРНК спинномозговой жидкости (miR-151a-3p, let-7f-5p) и 3 подавленные микроРНК (miR-27a-3p, miR-125a-5p и miR-423-5p), которые потенциально могут диагностировать раннюю стадию БП⁶. При патологических заболеваниях патологический статус может предшествовать определенным характерным симптомам заболеваний, тогда как при нейродегенерации накопление патологических признаков происходит гораздо раньше, чем снижение когнитивных функций.

МикроРНК потенциально являются более эффективным биомаркером, чем белки, благодаря их разнообразным функциям и эпигенетической регуляции более высокого порядка. Используя ткани мозга, исследователи потенциально могут идентифицировать специфические сигнатуры микроРНК sEV (BDsEV) мозга для заболеваний и их подтипов. Например, sEVs с нейрональными и глиальными маркерами могут представлять различный груз микроРНК, и анализ может привести к более точным методам выявления заболеваний. Кроме того, предполагается, что BDsEVs играют большую роль в транссинаптическом распространении нейропатогенных белков⁷. В предыдущих отчетах предлагалось ультрацентрифугирование с помощью иммунопреципитации и градиента плотности (градиента сахарозы) для получения sEV из свежезамороженной ткани мозга ^8,9. Однако эти подходы требуют специфической инфраструктуры с ультрацентрифугами и методами последующей очистки для получения высококачественных образцов sEV¹⁰. В более поздних отчетах предлагается несколько модификаций и улучшений подхода 11,12,13; однако, несмотря на это, выделение и изучение микроРНК, полученных из sEV, из тканей человека до сих пор не получили широкого распространения. Подход, описанный в этом протоколе, направлен на предоставление усовершенствованного, пошагового протокола для исследования sEV, полученного из мозга, чтобы повысить доступность этого метода. Мы разработали протокол с использованием минимального количества ткани мозга, из которой мы выделили чистые sEV с помощью эксклюзионной хроматографии и показали высококачественные данные секвенирования нового поколения из груза микроРНК этих sEV.

протокол

Работа была этически одобрена Манчестерским банком мозга (номер REC 09/H0906/52) и комитетом по этике Университета Солфорда (номер заявки: 3408).

1. Расщепление внутриклеточного матрикса с помощью коллагеназы на замороженных срезах ткани мозга

1. Тонкими ломтиками нарежьте 250 мг замороженной ткани мозга (фрагменты толщиной около 0,4 мм) с помощью стерилизованного скальпеля на холодной пластине и добавьте 2 мл 75 ЕД/мл раствора коллагеназы типа-III/гиберната-E.
2. Инкубируйте каждый образец на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут. На 5-минутной отметке переверните каждый образец два раза, чтобы перемешать; В течение 10 минут осторожно пипетируйте каждый образец три раза с помощью пластиковой одноразовой полоски объемом 10 мл.
3. Поместите каждый образец на лед и добавьте 1 коктейль ингибиторов протеазы и 1 ингибитор фосфатазы. Это останавливает ферментативную реакцию и является конечной точкой пищеварения с использованием коллагеназы типа III.
4. Центрифугируйте каждый образец ткани мозга при 300x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите каждую надосадочную жидкость и далее центрифугируйте при 2000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
5. Снова соберите каждую надосадочную жидкость и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Центрифугируйте каждый фильтрат при давлении 10 000 x g в течение 48 мин при 4 °C.
6. Соберите надосадочную жидкость и добавьте буфер осадков в соотношении 2:1 к каждой пробе. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
7. Центрифугируйте каждый образец при давлении 10 000 x g в течение 96 мин при 4 °C и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл PBS, свободного от внеклеточных везикул (EV).

2. Подготовка колонок эксклюзионной хроматографии

1. Перед использованием уравновесьте предварительно подготовленную колонку SEC при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя крышка должна быть снята до завинчивающейся крышки.
2. После уравновешивания удалите консервирующий буфер с верхней части колонки и дважды промойте колонку, используя 250 мкл PBS, не содержащего EV. Каждая промывка PBS остается для подачи в колонну под действием силы тяжести.

3. Выделение малых внеклеточных везикул с помощью эксклюзионной хроматографии

1. Добавьте ресуспензированную гранулу в верхнюю часть колонны SEC и центрифугируйте колонку при давлении 50 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
2. Добавьте 180 μL PBS без EV в верхнюю часть колонки SEC и центрифугируйте колонку при 50 x g в течение 1 минуты, позволяя полученным из мозга sEV вымываться из колонки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часть протокола, описанная выше, кратко изложена на рисунке 1.

4. Подтверждение маркеров малых внеклеточных везикул методом вестерн-блоттинга

1. Для лизиса sEVs перед вестерн-блоттингом (чтобы убедиться в анализе всех мембранных и цитозольных грузов) разведите изолированный образец sEV в соотношении 1:1 в буфере для лизиса и экстракции (1x ингибитор протеазы и 1x ингибитор фосфатазы).
2. Взбалтывайте образец при температуре 4 °C в течение 30 минут.
3. Центрифуга пробы при 14 000 x g в течение 15 мин.
4. Соберите надосадочную жидкость белка и измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка.
5. Смешайте образцы с 4 буферами Laemmli и загрузите по 20 г белка в каждую лунку по предварительно окрашенной белковой лестнице.
6. После рассасывания перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану размером 0,45 мкм. После переноса заблокируйте мембрану на 2 ч в 5% BSA.
7. Инкубируйте мембраны с первичными антителами (Таблица 1) в течение ночи.
8. Промойте мембрану три раза промывочным буфером (1% Tween20 в PBS) и окрасьте с помощью вторичного антитела против мыши. После этого трижды промойте с помощью буфера для стирки (1% Tween20 в PBS).
9. Выполните описанные выше действия, описанные в рукописи, прежде чем делать снимки клякс.
10. Изображение с использованием субстрата пероксидазы хрена (HRP).

5. Подтверждение малых внеклеточных везикул с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA)

1. Выполнение NTA для анализа концентрации и размера всех частиц в образце. Для этого необходимо разбавить каждый образец в PBS с коэффициентом разбавления 1:1000.
2. Введите образец в прибор NTA и считайте образец на длине волны 550 нм. На этом этапе используйте количество частиц для измерения количества белка на частицу (обычно выраженного в фемтограмме) в соответствии с рекомендациями MISEV.
3. Затем для флуоресцентного NTA разбавляют клеточную маску оранжевым цветом (CMO) (окрашивает все биологические частицы в образце) в PBS с коэффициентом разбавления 1:1000. После этого разбавьте краситель CMO с использованием образца sEV с коэффициентом разбавления 1:10 - Инкубируйте эту стадию разбавления в темноте в течение 30 минут при 4 °C.
4. Разбавьте второе разведение CMO с использованием PBS с коэффициентом разбавления 1:1000.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательное разведение красителя CMO должно составлять 1:10 000 000.
5. Считывание CMO каждого образца sEV на длине волны 550 нм с помощью прибора NTA.
6. Для флуоресцентных антител тетраспанина (см. Таблицу материалов) сначала разбавляют каждое соответствующее антитело в PBS с коэффициентом разведения 1:10. Исходя из этого, разбавьте каждый из красителей с помощью образца sEV с коэффициентом разбавления 1:10 - Инкубируйте стадию разбавления в темноте в течение 2 ч при 4 °C.
7. Разбавляют второе разведение антител с помощью PBS с коэффициентом разведения 1:1000.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательное разведение каждого антитела тетраспанина должно составлять 1:100 000.
8. Считывание показаний флуоресцентных антител образца sEV на длине волны 550 нм с помощью прибора NTA.

6. Подтверждение малых внеклеточных везикул методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был выполнен Центром биомедицинской микроскопии Ливерпульского университета.

1. Во-первых, закрепите образцы sEV с помощью глутарового альдегида и окрасите уранилацетатом.
2. С помощью градуированного ряда спиртов обезвожьте образец, готовый к ПЭМ.
3. Изображения образцов с помощью подходящего просвечивающего электронного микроскопа.

7. Лечение протеиразой К и РНКазой А

1. К 50 мкл выделенных производных из мозга EVs добавьте 1 мкл 20 мкг/мкл протеиназы K и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
2. Останавливайте каждую реакцию, добавляя 1x коктейль ингибиторов протеиназы и инкубируйте на льду в течение 10 минут.
3. После инкубации добавьте 1 мкл 10 мкг/мкл РНКазы А в каждый образец и далее инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно переходите к разделу 8.

8. Выделение полной РНК из мелких внеклеточных везикул

1. Чтобы выделить общую РНК, добавьте 700 мкл высококачественного реагента для лизиса восстановления РНК к 50 мкл образца EV, полученного из мозга (BDsEV). Взбалтывайте каждый образец в течение 1 ч.
2. Добавьте 140 μл хлороформа, энергично встряхните каждый образец в течение 20 секунд и оставьте инкубироваться при RT на 3 минуты.
3. Центрифугируйте образец при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C и соберите промежуточную фазу из образца. Добавьте в 1,5 раза больше 100% этанола.
4. Добавьте 700 мкл интерфазы/смеси этанола, колонки для выделения РНК и центрифугуйте при ≥8000 x g в течение 15 с при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг, используя все образцы интерфазы/этанола.
5. В колонку добавьте 700 μл промывочного буфера и центрифугуйте при ≥8000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока.
6. Добавьте 500 μл буферного RPE и снова центрифугируйте при ≥8000 x g в течение 15 с. Откажитесь от проточного потока.
7. Добавьте 500 μл 80% этанола и центрифугируйте при ≥8000 x g в течение 2 минут. Откажитесь от проточного потока.
8. На этом этапе высушите мембрану колонны, центрифугируя колонны на полной скорости (>8000 x g) в течение 5 минут при открытой крышке.
9. Перенесите колонку в новую пробирку для сбора, добавьте 14 μL воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в мембрану колонки и центрифугируйте при ≥8000 x g в течение 1 минуты для элюирования общей РНК из BDsEVs.
10. Количественно оценивайте общее количество микроРНК с образцами с помощью набора для количественного анализа микроРНК, где образцы измеряли на флуориметре количественного анализа, выбирая тип анализа микроРНК.

9. Секвенирование малых РНК

1. После количественного определения микроРНК в образце синтезируйте библиотеку кДНК с помощью набора для подготовки библиотеки малых РНК-Seq.
   Примечание: При использовании этого протокола создание библиотеки включало четыре этапа: 3'-лигирование адаптера, очистка, 5'-лигирование адаптера и обратная транскрипция, где, в конечном итоге, формируется библиотека РНК/кДНК. После генерации библиотеки происходит апплификация ПЦР в конечной точке с добавлением индексных праймеров (используемых для мультиплексирования), после чего образцы очищаются.
2. Чтобы проверить качество РНК, используйте прикладной анализ для контроля качества с подробным описанием размера каждого препарата и пиковой интенсивности.
3. Чтобы проверить концентрацию ДНК, измерьте количественное определение ДНК на флюориметре количественного анализа, выбрав тип анализа дцДНК.
4. Подготовьте образцы для секвенирования малых РНК с помощью набора реагентов, после чего образцы загружаются в проточную ячейку.

Результаты

Чтобы подтвердить наличие BDsEVs, были использованы три метода: вестерн-блоттинг, NTA и TEM (рис. 3). Результаты вестерн-блоттинга (Рисунок 3A и Дополнительный файл 1) показывают наличие всех пяти положительных маркеров (CD9, CD63, CD81, Flot-1 и TS...

Обсуждение

Этот модифицированный и улучшенный протокол выделения малых внеклеточных везикул мозга и их микроРНК демонстрирует возможность использования минимального количества ткани без ущерба для качества и количества продуктов на последующих этапах. В области открытия би...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094