通过卵巢切除术创建骨肌减少症的大鼠模型

摘要

目前的方案概述了使用卵巢切除术创建骨arc减少症大鼠模型的程序。

摘要

骨质减少症 （OS） 是一种复杂的退行性疾病，其特征是骨骼肌质量和骨密度 （BMD） 同时下降，对老年人群的健康构成巨大危害。尽管具有临床相关性，但 OS 背后的病理生理机制尚不完全清楚，这强调了更深入地了解其病因以促进有效治疗策略的必要性。在这项工作中，开发可靠的动物模型至关重要。本研究提出了一种通过双侧卵巢切除术诱导大鼠绝经后骨质减少症的改进方案，已知这种方法会加速与年龄相关的肌肉和骨质流失的发生。在本研究中，12 周龄大鼠按体重分层，随机分配到假手术组或去卵巢 （OVX） 组。在术后 4 、 8 和 12 周系统收集来自左后肢股四头肌和肱三头肌以及左股骨的组织样本。这种有方法的方法确保了对卵巢切除术对肌肉和骨骼健康的影响的全面评估。使用苏木精和伊红 （HE） 染色进行肌纤维萎缩和股骨形态的组织学评估，同时使用双能 X 射线吸收测定法 （DXA） 量化骨密度。在上述间隔仔细监测 OS 的时间进展，为肌肉和骨骼变性之间的动态相互作用提供了见解。该模型不仅准确反映了 OS 的临床表现，而且还为研究新的治疗方法及其潜在机制提供了一个强大的平台。

引言

骨肌肉减少症是一种多方面的退行性疾病，概括了骨质疏松症和肌肉减少症的临床表现 1,2,3,4。骨质疏松症是一种常见的骨骼疾病，其特征是骨量减少、微结构受损和对骨折的易感性增加。肌肉减少症，通常被称为肌肉萎缩综合征，其典型表现是肌肉力量和质量下降 ^5,6。Maryam 的⁷ 项发现显示，骨肌肉减少症的死亡风险比单独的肌肉减少症增加了 30%，比单独的低 BMD 增加了 8%。研究表明，16.4% 的 60 岁及以上的社区居民患有骨肌肉减少症⁸。据报道，在韩国，60 岁及以上持续髋部骨折的老年人骨肌肉减少症的发病率为 27.2%⁹。患有 OS 的人面临更高的跌倒、骨折、住院和住院风险，这给医疗保健系统和社会带来了负担^10,11。鉴于这些后果的严重性，制定和实施有效的预防和治疗 OS 的措施至关重要。尽管紧迫，但该领域的研究仍处于起步阶段，围绕诊断标准和各种治疗方式的疗效的争论仍在进行中。因此，开发可靠的动物模型对于剖析 OS 的发病机制和揭示可以为更有效的治疗方法提供信息的分子基础至关重要。

目前，骨肌肉减少症临床前研究常用的模型包括衰老模型，该模型模拟人类衰老过程，无需药物干预。这种方法更接近自然过程并且具有成本效益;然而，它需要投入大量时间才能成熟¹².化学药物注射法具有一定的优点，例如建模周期短、结果稳定和成本低。然而，它也带来了挑战，包括精确确定激素剂量、注射所需的技术技能以及激素干预的不同效果^13,14。基因工程模型可能涉及转基因生物，这些生物体可能既有基因缺陷又成本高昂。尽管这些模型具有高度特异性，但它们的生产成本明显更高¹⁵.废弃模型模拟了长时间卧床休息对临床患者的影响¹⁶。废弃模型对于解决肌肉流失问题既有效又具有成本效益，但与血栓和压疮等并发症有关。这些模型受到常规监测，以防止肢体坏死^17,18 和激素缺乏模型;科学界普遍认为，双侧卵巢切除术是建立骨质疏松症动物模型的有效方法^19,20。

研究表明，骨骼和肌肉组织也可以通过自分泌、内分泌和旁分泌机制相互相互作用²¹。脂肪组织在肌肉和骨髓中的积累是骨肌肉减少症² 中骨骼和肌肉质量减少的指标。老年人的肌肉减少症与骨密度降低和骨微结构恶化直接相关。此外，肌肉质量减少是骨微结构退化的独立风险因素²²。这种方法已被公认为肌肉减少症建模的可行策略^23,24，^它可能作为两种情况的组合模型²⁵。尽管关于卵巢切除术作为诱导骨肌肉减少症的方法的研究有限，但这种方法显示出潜在的疗效。在临床前研究中利用卵巢切除术的好处包括快速建模过程、消除药物干预、创建稳定的实验模型、直接实施和成本效益。

本研究旨在描述通过切除非怀孕个体的输卵管和卵巢段在雌性大鼠中创建临床前模型的程序。这种方法是研究 OS 的分子基础和在受控实验环境中评估干预的治疗益处的宝贵工具。

研究方案

雌性 Sprague Dawley 大鼠 （n = 36），年龄 12 周，体重约 200-240 g，单独饲养在无特定病原体 （SPF） 动物室的通风笼中，光照/黑暗循环 12 小时。他们可以免费获得 SPF 饲料和无菌水。在实验前一周，让大鼠适应环境。采用随机分配方法，将大鼠分为去卵巢 （OVX） 组 （每组 6 只大鼠） 和假手术组 （每组 6 只大鼠） 术后 4 、 8 和 12 周。所有动物程序均按照辽宁中医药大学动物福利委员会批准的指导方针（第 21000042021040 号）进行。

1. 大鼠卵巢切除术

注意：本协议中使用的手术器具如图 1 所示。

1. 将大鼠饲养在 SPF 动物房中，并在无菌环境中使用消毒设备遵循所有必要的程序。
2. 将戊巴比妥钠（一种白色粉末）与蒸馏水或 0.9% 生理盐水溶液混合，制成麻醉溶液。标准剂量为 30 mg/kg;相应地填充注射器。
   注意：需要注意的是，该解决方案不稳定，应立即使用。一次准备一个实验所需的量。
3. 将大鼠的腹部抬高至头顶以上，将内脏移至上腹部。用惯用手，将注射器放置在距离腹部中线左侧（或右侧）1-1.5 厘米的位置，并以 45° 角插入大鼠体内。给药后，旋转针头，然后退出。
4. 麻醉后，仔细监测大鼠的呼吸并捏住它们的脚趾以确认它已被完全麻醉。
   注意：如果有任何痉挛或抽搐的迹象，建议等待更长时间再继续。
5. 将大鼠放在手术台上，固定其四肢，并使用修剪器去除其背部两侧的毛发（图 2A）。
   注意：如果脱毛效果不理想，可以使用脱毛霜进行脱毛。
6. 使用浸泡在碘中的棉球对脱毛区域进行消毒。
   注意：手术消毒的过程包括从中心开始，以圆周模式向外移动，通常重复 3 次。
7. 在背面切开一个，距离中心线约 1.0 厘米。将切口靠近肋骨弯曲和脊柱边界之间的交界处，通过将两侧的皮肤、筋膜和肌肉分开，略微降低 0.5-1 厘米（图2B）。
   注意：为了通过后腹壁较弱的肌肉层进入腹腔，切口应尽可能减少。
8. 一开始找到卵巢可能具有挑战性。首先找到输卵管并将其追踪到卵巢的末端，卵巢末端包裹在一层松散的脂肪组织中。
   注意：右卵巢位于第 4 至第 5 腰椎的一侧，位于肾脏后方 7-12 毫米处，距离中心线 15 毫米处。左卵巢位于第 5 至第 6 腰椎的一侧，肾后 3-5 毫米，距中心线 11 毫米。
9. 小心地将卵巢和输卵管末端从体内提起（图 2C）。将止血钳套在子宫末和卵巢之间最狭窄的区域。用手术线将其系好，然后用剪刀完全切除卵巢。
   注意：在手术过程中处理输卵管和子宫时要轻柔，避免过度拉扯，这一点至关重要。卵巢切除术前使用的结扎线必须牢固固定，因为卵巢周围的软脂质组织很容易导致其松动。这种预防措施对于防止术后出血是必要的，这可能会导致大鼠死亡。在假手术组中，切除卵巢附近体积和大小相等的脂肪组织，然后缝合肌肉和皮肤。
10. 松开止血钳，轻轻地将子宫放回腹腔。
11. 将青霉素涂抹在卵巢和输卵管结扎的腹部伤口上，以避免感染。
    注意：青霉素 80,000 单位/大鼠，每天一次，连续 3 天。
12. 单独缝合（尺寸 3-0）皮肤和肌肉层（图 2D）。
    注意：消毒应在手术后 24-48 小时进行，间隔 1-2 天。
13. 将大鼠放回消毒过的笼子中并对其进行监测，直到它从麻醉中完全恢复意识。
    注意：在手术过程中继续提供热支持，直到动物从麻醉中完全恢复。
14. 为避免伤口感染，每组大鼠肌肉注射青霉素钠 80,000 单位/大鼠，每天一次，连续 3 天²⁶。

2. 骨组织和肌肉组织的收集

注意：在建模手术后 4、 8 和 12 周用过量的戊巴比妥钠 （100-200 mg/kg） 对大鼠实施安乐死。共收集了 36 个样本。

1. 露出左小腿的肱三头肌和股四头肌。仔细识别和解剖这些肌肉的起点和终点，以保持其完整性。在此之后，记录并计算肌肉湿重的平均值，以确定肌肉的湿重系数。
   注：动物体重和骨骼肌湿重系数 = 大鼠肌肉湿重/体重。
2. 沿股骨向上切开关节囊，完全分离股骨。然后，消除附近的肌肉和韧带组织。

3. 病理检查

1. 将肌肉组织浸入含有 10% 中性缓冲福尔马林溶液的容器中 24 小时。在此之后，在流水下广泛冲洗肌肉组织以去除固定剂。
2. 将左股骨置于 4% 多聚甲醛溶液中 1 周，然后将其浸泡在足量的乙二胺四乙酸 （EDTA） 脱钙溶液中以去除钙沉积物，每天更换缓冲液。
3. 使用双能 X 射线吸收测定法 （DXA） 骨密度计测量骨密度值。将股骨置于双能 X 射线中。将测量精度设置为 精细，将模式调整为 小动物特异性模式，并使用随附的 BMD 分析软件分析大鼠股骨的 BMD。
4. 将样品放入石蜡中。将样本切片以进行常规组织学检查²⁷.

4. 统计分析

1. 将连续变量表示为均值±±标准差 （SD），并使用独立样本 t 检验在两组之间进行比较。所有统计分析均采用双侧方法，统计显着性设置为 P < 0.05。使用适当的数据分析软件进行数据分析。

结果

该方案提供了用于建立骨肌减少大鼠模型的双侧卵巢切除术程序的详细描述。 图 3 显示与假手术组相比，OVX 组股四头肌的湿重系数降低。虽然术后 4 周两组 BMD 差异无统计学意义，但 OVX 组术后 8 周和 12 周的 BMD 显著低于假手术组。

在图 4 中，在 OVX 组中?...

讨论

双侧卵巢切除动物模型有助于阐明骨肌肉减少症的机制和评估潜在的治疗干预措施。卵巢切除术诱导的大鼠骨质疏松症反映了绝经后妇女雌激素水平的突然下降，通常被用作骨质疏松症研究的模型。此外，研究强调了老年人骨质疏松症和肌肉减少症之间的显着关联，经常观察到并发的肌肉和骨骼流失。因此，许多研究利用该模型来调查肌肉减少症^28,29

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Disposable medication changing tray	Yangzhou Chenglin Medical Technology Co., Ltd.	RVnpFXLc
Dual Energy X-ray Bone Densitometer	Xuzhou PinyuanElectronic Technology Co., Ltd.	DXA-800E
Iodine	Shanghai Likang Sterilization Hi-Tech Co., Ltd.	LK-310512
IVCs rat cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Group Limited Liability  Co., Ltd.	H13020654
sodium pentobarbital	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P3761-5G
Sterile cotton ball	Henan Piaoan Group Co., Ltd	20140017
Straight Mayo scissors	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-0410
Straight needle holder	Shanghai Simplicity Biotechnology Co., Ltd.	32100-14
Suture line	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-5902
Suture needle	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-5036
Syringes	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	21-3021