La création d’un modèle de rat pour l’ostéosarcopénie par ovariectomie

Résumé

Le présent protocole décrit une procédure de création d’un modèle d’ostéosarcopénie chez le rat à l’aide de l’ovariectomie.

Résumé

L’ostéosarcopénie (OS), une maladie dégénérative complexe, se caractérise par le déclin simultané de la masse musculaire squelettique et de la densité minérale osseuse (DMO), ce qui pose un énorme risque pour la santé de la population âgée. Malgré sa pertinence clinique, les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la SG ne sont pas entièrement compris, ce qui souligne la nécessité d’une compréhension plus profonde de son étiologie pour faciliter l’adoption de stratégies de traitement efficaces. Le développement d’un modèle animal fiable est essentiel dans cette entreprise. Cette étude présente un protocole affiné pour l’induction de l’ostéosarcopénie postménopausique chez le rat par ovariectomie bilatérale, une méthode connue pour accélérer l’apparition de la perte musculaire et osseuse liée à l’âge. Dans cette étude, des rats âgés de 12 semaines ont été stratifiés en fonction de leur poids corporel et répartis au hasard dans un groupe d’opération simulée ou dans un groupe ovariectomisé (OVX). Des échantillons de tissus des muscles quadriceps et triceps du membre postérieur gauche, ainsi que du fémur gauche, ont été systématiquement prélevés 4, 8 et 12 semaines après la chirurgie. Cette approche méthodique permet d’assurer une évaluation complète des effets de l’ovariectomie sur la santé musculaire et osseuse. L’évaluation histologique de l’atrophie des fibres musculaires et de la morphologie fémorale a été réalisée à l’aide de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE), tandis que la densité minérale osseuse a été quantifiée à l’aide de l’absorptiométrie à rayons X à double énergie (DXA). La progression temporelle de la SG a été méticuleusement surveillée aux intervalles susmentionnés, ce qui a permis de mieux comprendre l’interaction dynamique entre la dégénérescence musculaire et osseuse. Ce modèle reflète non seulement avec précision les manifestations cliniques de la SG, mais sert également de plate-forme solide pour l’étude de nouvelles approches thérapeutiques et de leurs mécanismes sous-jacents.

Introduction

L’ostéosarcopénie est une maladie dégénérative à multiples facettes qui englobe les manifestations cliniques de l’ostéoporose et de la sarcopénie 1,2,3,4. L’ostéoporose, un trouble squelettique répandu, se caractérise par une diminution de la masse osseuse, une microarchitecture compromise et une susceptibilité accrue aux fractures. La sarcopénie, souvent appelée syndrome de fonte musculaire, se caractérise par une réduction de la force et de la masse musculaires ^5,6. Les⁷ résultats de Maryam ont révélé que l’ostéosarcopénie augmentait le risque de décès de 30 % par rapport à la sarcopénie seule et de 8 % par rapport à la DMO faible seule. Des recherches ont montré que 16,4 % des personnes âgées de 60 ans et plus vivant dans la communauté sont touchées par l’ostéosarcopénie⁸. En Corée du Sud, l’incidence de l’ostéosarcopénie chez les personnes âgées de 60 ans et plus ayant subi une fracture de la hanche serait de 27,2 %⁹. Les personnes atteintes de SG courent des risques plus élevés de chutes, de fractures, d’hospitalisation et d’institutionnalisation, ce qui pèse sur le système de santé et la société^10,11. Compte tenu de la gravité de ces conséquences, il est crucial d’élaborer et de mettre en œuvre des mesures efficaces de prévention et de traitement de la SG. Malgré l’urgence, la recherche dans ce domaine n’en est qu’à ses balbutiements, avec des débats en cours autour des critères de diagnostic et de l’efficacité des différentes modalités de traitement. Le développement de modèles animaux fiables est donc essentiel pour disséquer la pathogenèse de la SG et découvrir les fondements moléculaires qui pourraient éclairer des approches de traitement plus efficaces.

À l’heure actuelle, les modèles couramment utilisés pour les études précliniques sur l’ostéosarcopénie comprennent le modèle du vieillissement, qui simule le processus de vieillissement humain sans intervention médicamenteuse. Cette approche est plus proche du processus naturel et est rentable ; Cependant, il demande un investissement important en temps pour la maturation¹². La méthode d’injection chimique de médicament offre certains avantages, tels qu’un cycle de modélisation court, des résultats stables et un faible coût. Cependant, elle présente également des défis, notamment la détermination précise de la dose d’hormones, les compétences techniques requises pour l’injection et les effets variables des interventions hormonales^13,14. Les modèles de génie génétique peuvent impliquer des organismes génétiquement modifiés qui peuvent être à la fois génétiquement défectueux et coûteux. Bien que ces modèles soient très spécifiques, ils sont nettement plus complexes et coûteux à produire¹⁵. Les modèles de non-utilisation simulent les effets d’un alitement prolongé sur des patients cliniques¹⁶. Les modèles de désutilisation sont efficaces et rentables pour traiter la perte musculaire, mais sont associés à des complications telles que des caillots sanguins et des escarres. Ces modèles sont régulièrement surveillés pour prévenir la nécrose des membres ^17,18 et les modèles déficients en hormones ; La communauté scientifique s’accorde à dire que l’ovariectomie bilatérale est une méthode efficace pour établir un modèle animal de l’ostéoporose^19,20.

La recherche indique que les tissus osseux et musculaires peuvent également interagir les uns avec les autres par des mécanismes autocrines, endocriniens et paracrines²¹. L’accumulation de tissu adipeux dans les muscles et la moelle osseuse sert d’indicateur de réduction de la masse osseuse et musculaire dans le contexte de l’ostéosarcopénie². La sarcopénie chez les personnes âgées est directement associée à une réduction de la densité osseuse et à la détérioration de la microarchitecture osseuse. De plus, la diminution de la masse musculaire sert de facteur de risque indépendant pour la dégradation de la microstructure osseuse²². Cette méthodologie a été reconnue comme une stratégie viable pour la modélisation de la sarcopénie^23,24, qui pourrait potentiellement servir de modèle combiné pour les deux conditions²⁵. Malgré le nombre limité de recherches concernant l’application de l’ovariectomie comme moyen d’induire l’ostéosarcopénie, cette approche démontre une efficacité potentielle. Les avantages de l’utilisation de l’ovariectomie dans les études précliniques comprennent un processus de modélisation rapide, l’élimination des interventions pharmacologiques, la création d’un modèle expérimental stable, une mise en œuvre simple et un rapport coût-efficacité.

La présente étude vise à délimiter la procédure de création d’un modèle préclinique chez des rats femelles par l’ablation d’un segment des trompes de Fallope et des ovaires chez des personnes non enceintes. Cette approche constitue un outil précieux pour étudier les fondements moléculaires de la SG et pour évaluer les avantages thérapeutiques des interventions dans un cadre expérimental contrôlé.

Protocole

Des rats Sprague Dawley femelles (n = 36), âgés de 12 semaines et pesant environ 200 à 240 g, ont été logés individuellement dans des cages ventilées dans une salle animalière exempte d’agents pathogènes spécifiques (FPS) avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Ils avaient libre accès à de la nourriture SPF et à de l’eau stérile. Les rats ont été laissés s’acclimater à l’environnement pendant une semaine avant les expériences. À l’aide d’une répartition aléatoire, les rats ont été divisés en groupes ovariectomisés (OVX) (chacun avec 6 rats) et en groupes simulés (chacun avec 6 rats) pendant 4, 8 et 12 semaines après la chirurgie. Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives approuvées par le comité de bien-être animal de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning (n° 21000042021040).

1. Ovariectomie chez le rat

REMARQUE : L’appareil chirurgical utilisé dans ce protocole est illustré à la figure 1.

1. Gardez les rats dans la salle des animaux du FPS et suivez toutes les procédures nécessaires à l’aide d’un équipement stérilisé dans un environnement stérile.
2. Mélangez du pentobarbital de sodium, une poudre blanche, avec de l’eau distillée ou une solution saline normale à 0,9 % pour créer une solution anesthésique. La dose standard est de 30 mg/kg ; Remplissez la seringue en conséquence.
   REMARQUE : Il est important de noter que la solution est instable et doit être utilisée immédiatement. Préparez la quantité requise pour une expérience à la fois.
3. Élevez l’abdomen du rat au-dessus de sa tête pour déplacer les viscères vers la partie supérieure de l’abdomen. À l’aide de la main dominante, placez une seringue à 1 à 1,5 cm du côté gauche (ou droit) de la ligne médiane de l’abdomen et insérez-la à un angle de 45° dans le corps du rat. Une fois la solution médicamenteuse administrée, tournez l’aiguille, puis retirez-la.
4. Après l’administration de l’anesthésie, surveillez attentivement la respiration du rat et pincez ses orteils pour confirmer qu’il est complètement anesthésié.
   REMARQUE : S’il y a des signes de spasmes ou de convulsions, il est conseillé d’attendre plus longtemps avant de continuer.
5. Placez le rat sur la table d’opération, fixez ses membres et retirez les poils des deux côtés de son dos à l’aide d’une tondeuse (Figure 2A).
   REMARQUE : Si l’effet d’épilation n’est pas idéal, la crème dépilatoire peut être utilisée pour l’épilation.
6. Désinfectez la zone où les poils ont été enlevés à l’aide de boules de coton imbibées d’iode.
   REMARQUE : Le processus de désinfection chirurgicale consiste à partir du centre et à se déplacer vers l’extérieur dans un motif circulaire, généralement répété trois fois.
7. Faites une incision sur le dos, à environ 1,0 cm de la ligne médiane. Faites l’incision près de la jonction entre la courbure de la cage thoracique et le bord de la colonne vertébrale, légèrement abaissée de 0,5 à 1 cm en séparant la peau, le fascia et le muscle des deux côtés (Figure 2B).
   REMARQUE : Pour accéder à la cavité abdominale par la couche musculaire la plus faible de la paroi abdominale postérieure, l’incision est maintenue aussi minimale que possible.
8. Trouver l’ovaire peut être difficile au début. Commencez par localiser l’oviducte et tracez-le jusqu’à l’extrémité terminale de l’ovaire, qui est enfermée dans une couche de tissu adipeux lâche.
   REMARQUE : L’ovaire droit est positionné sur le côté des 4e à 5e vertèbres lombaires, 7-12 mm derrière le rein et 15 mm de la ligne médiane. L’ovaire gauche est situé sur le côté de la 5e à la 6e vertèbre lombaire, à 3-5 mm derrière le rein et à 11 mm de la ligne médiane.
9. Soulevez avec précaution l’ovaire et l’extrémité de l’oviducte hors du corps (Figure 2C). Appliquez la pince hémostatique dans la région la plus rétrécie entre l’extrémité utérine et l’ovaire. Utilisez un fil chirurgical pour l’attacher, puis excisez complètement l’ovaire avec des ciseaux.
   REMARQUE : Il est crucial d’être doux lors de la manipulation de l’oviducte et de l’utérus pendant la procédure, en évitant de tirer excessivement. La ligature utilisée avant l’ovariectomie doit être solidement fixée, car le tissu lipidique mou autour de l’ovaire peut facilement le faire se détacher. Cette précaution est nécessaire pour prévenir les saignements postopératoires, qui pourraient entraîner la mort des rats. Dans le groupe fictif, le tissu adipeux de volume et de taille égaux adjacent à l’ovaire a été excisé, suivi d’une suture du muscle et de la peau.
10. Relâchez la pince hémostatique et ramenez doucement l’utérus dans la cavité abdominale.
11. Administrez de la pénicilline aux plaies abdominales où les ovaires et les trompes de Fallope sont ligaturés pour éviter l’infection.
    REMARQUE : Administrer la pénicilline 80 000 unités/rat une fois par jour pendant 3 jours consécutifs.
12. Suturez individuellement (taille 3-0) les couches cutanées et musculaires (Figure 2D).
    REMARQUE : La stérilisation doit être effectuée 24 à 48 heures après la chirurgie, espacées de 1 à 2 jours.
13. Remettez le rat dans une cage aseptisée et surveillez-le jusqu’à ce qu’il reprenne complètement conscience après l’anesthésie.
    REMARQUE : Continuez à fournir un soutien thermique pendant la procédure jusqu’à ce que l’animal soit complètement rétabli de l’anesthésie.
14. Pour éviter l’infection de la plaie, administrez aux rats de chaque groupe une injection intramusculaire de pénicilline sodique 80 000 unités/rat une fois par jour pendant 3 jours consécutifs²⁶.

2. Prélèvement de tissu osseux et musculaire

REMARQUE : Des rats ont été euthanasiés avec une surdose de pentobarbital sodique (100-200 mg/kg) 4, 8 et 12 semaines après la chirurgie de modélisme. Au total, 36 échantillons ont été prélevés.

1. Exposez les muscles triceps brachiaux et quadriceps du mollet gauche. Identifiez et disséquez soigneusement ces muscles à leurs points d’origine et d’extrémité afin de préserver leur intégrité. Ensuite, enregistrez et calculez la moyenne des poids humides des muscles pour déterminer les coefficients de poids humide des muscles.
   REMARQUE : Poids corporel de l’animal et coefficient de poids humide des muscles squelettiques = poids humide des muscles du rat/poids corporel.
2. Détachez complètement le fémur en coupant la capsule articulaire vers le haut le long du fémur. Ensuite, éliminez le tissu musculaire et ligamentaire à proximité.

3. Examen pathologique

1. Immerger les tissus musculaires dans un récipient contenant une solution de formol tamponnée neutre à 10 % pendant une durée de 24 h. Ensuite, rincez abondamment les tissus musculaires sous l’eau courante pour éliminer le fixateur.
2. Placez le fémur gauche dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 semaine, puis trempez-le dans une quantité suffisante de solution de détartrage d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour éliminer les dépôts de calcium, le tampon étant changé quotidiennement.
3. Mesurez les valeurs de densité minérale osseuse à l’aide d’un densitomètre osseux par absorptiométrie à rayons X à double énergie (DXA). Placez le fémur dans une radiographie à double énergie. Réglez la précision de mesure sur Fine, ajustez le mode sur Mode spécifique aux petits animaux, et analysez la DMO des fémurs de rat à l’aide du logiciel d’analyse de la DMO qui l’accompagne.
4. Placez l’échantillon dans de la cire de paraffine. Sectionner les échantillons pour l’examen histologique de routine²⁷.

4. Analyse statistique

1. Présentez les variables continues sous forme de moyenne ±± d’écart-type (ET) et comparez les deux groupes à l’aide du test t de l’échantillon indépendant. Toutes les analyses statistiques ont suivi une approche bilatérale, la signification statistique étant fixée à P < 0,05. Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié pour effectuer des analyses de données.

Résultats

Ce protocole fournit une description détaillée de la procédure d’ovariectomie bilatérale pour établir un modèle d’ostéosarcopénie chez le rat. La figure 3 montre une diminution du coefficient de poids humide du muscle quadriceps dans le groupe OVX par rapport au groupe simulé. Bien qu’il n’y ait pas eu de variance statistiquement significative de la DMO entre les deux groupes 4 semaines après la chirurgie, l...

Discussion

Le modèle animal ovariectomisé bilatéral joue un rôle déterminant dans l’élucidation des mécanismes sous-jacents à l’ostéosarcopénie et l’évaluation des interventions thérapeutiques potentielles. L’ostéoporose induite par l’ovariectomie chez le rat, qui reflète la diminution soudaine des niveaux d’œstrogènes observée chez les femmes ménopausées, est couramment utilisée comme modèle pour la recherche sur l’ostéoporose. De plus, la recherche a mis en év...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Disposable medication changing tray	Yangzhou Chenglin Medical Technology Co., Ltd.	RVnpFXLc
Dual Energy X-ray Bone Densitometer	Xuzhou PinyuanElectronic Technology Co., Ltd.	DXA-800E
Iodine	Shanghai Likang Sterilization Hi-Tech Co., Ltd.	LK-310512
IVCs rat cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Group Limited Liability  Co., Ltd.	H13020654
sodium pentobarbital	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P3761-5G
Sterile cotton ball	Henan Piaoan Group Co., Ltd	20140017
Straight Mayo scissors	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-0410
Straight needle holder	Shanghai Simplicity Biotechnology Co., Ltd.	32100-14
Suture line	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-5902
Suture needle	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	18-5036
Syringes	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd.	21-3021