开发临床前吸入模型以测试汽化大麻馏出物

摘要

大麻馏出物电子烟弹是电池供电的设备，可将含有高浓度大麻素的提取物雾化。这些产品缺乏既定的临床前模型，这给研究它们的生理效应带来了挑战。为了解决这一差距，已经开发了一种用于汽化大麻馏出物的标准化临床前吸入鼠模型。

摘要

尽管大麻电子烟产品越来越受欢迎，但对大麻电子烟产品的研究仍然不足。大麻电子烟烟弹与电池供电设备一起使用，这些设备将含有高浓度大麻素（如 THC）的大麻花提取物雾化。这些类型的产品通常被称为大麻馏出物。这些产品的效力为确定临床前研究的有效剂量带来了挑战。目前，还没有建立的标准化临床前模型来以类似于人类使用模式的方式测试这些产品的安全性和有效性。因此，与人类相比，达到生理相关剂量所需的 体内 大麻馏出物暴露制度仍未确定。为了解决这一差距，已经使用计算机控制的输送系统开发了一种用于吸入汽化大麻馏出物的标准化临床前小鼠模型。该协议详细介绍了通过仅鼻子暴露塔使用有序的泡芙地形对小鼠施用大麻 vape 馏出物的程序。还提供了监测小鼠暴露后行为结果的方法，以及利用半定量 ELISA 确认 THC 递送到体循环中。该协议将允许有兴趣使用真实世界交付协议探索大麻电子烟影响的研究人员调查对大麻电子烟馏出物产品的肺部和全身反应，从而为严格的安全性和治疗评估提供机会。

引言

随着大麻合法化在世界各地发生，大麻的使用正在增加。大麻零售市场的重大变化不仅提高了可及性，而且这些变化还推动了新型大麻产品的开发和生产¹.蒸发器在不燃烧的情况下加热大麻产品，正成为一种越来越流行的消费方式 ^2,3。蒸发器包括大麻电子烟烟弹，它们利用电子烟技术对大麻馏出物进行加热和雾化。这些馏出物是从大麻花中提取的，以产生具有高浓度大麻素的粘稠液体，例如 Δ⁹-四氢大麻酚 （THC），这是大麻⁴ 的主要精神活性成分。这些设备易于使用和隐藏，对新手用户具有吸引力⁵.在加拿大，大麻于 2018 年被合法化用于娱乐目的，获得的调查数据显示，人们对电子烟大麻的社会接受度有所提高，大麻电子烟笔/墨盒的使用量也显着增加⁶。

大麻消费者可能认为，吸食大麻馏出物比以关节形式吸食干花更安全，这有助于其越来越受欢迎²。尽管在使用大麻电子烟馏出物时可能会减少接触吸入燃烧产物的机会，但这些产品可能并非没有风险。一个问题是暴露于商业电子烟烟弹中存在的高剂量大麻素。干大麻花可以购买高达 36% 的 THC，而大麻馏出物盒中的 THC 浓度可高达 96%⁷。与大麻烟雾相比，大麻馏出物盒中的气溶胶含有大约两倍的 THC 浓度 ^8,9。目前尚不清楚这些升高的 THC 浓度对呼吸道有什么影响。此外，高浓度的 THC 为确定临床前小鼠研究的有效剂量带来了挑战，因为过量的 THC 暴露本身可能对小鼠产生不利影响¹⁰。必须从最低暴露水平开始，逐渐增加，直到达到生理相关的剂量，以确保这些暴露是相关的。

迄今为止，还没有研究检查吸入汽化大麻馏出物的潜在影响。这在一定程度上是由于缺乏现有的标准化临床前模型。在这些产品仍然是非法的地区，研究挑战更加复杂，这促使研究人员生产可能无法准确反映商业产品的内部馏分油¹¹。此外，可用的产品种类繁多，使标准化变得复杂。为了弥合这一差距，本研究使用加拿大消费者可获得的合法、市售产品启动。在安大略省大麻商店中被列为最畅销的产品和设备被选中使用。该方案的目标是建立一种易于使用的小鼠暴露方案，提供与生理相关的人类水平相当的 THC 剂量，为研究人员对汽化大麻馏出物的呼吸和全身影响进行额外研究奠定基础。

研究方案

根据加拿大动物护理委员会 （CCAC） 的指导方针，麦吉尔大学机构动物护理委员会（协议编号 8087）批准了以下程序。

1. 设备准备

注意：以下协议适用于 flexiWare 8 软件支持的 SCIREQ inExpose 系统。

1. 确保系统的所有组件正确组装，以类似于 图 1A 中所示的示例。确保将封闭的管子插入膨化泵的缓冲室中，以防止系统泄漏，如图 1B 所示。
2. 打开系统并启动软件。选择 Experimentation Sessions 模块。
3. 选择 New Study 并定义要研究的实验组和主题。选择与所需曝光方案相对应的实验模板。
4. 在 Session Properties （会话属性） 窗口中，完成 Operator （作员） 部分以跟踪设备使用情况。
5. 要执行校准，请选择 Desired Channel（所需通道 ），然后按照作软件中描述的步骤进行作。
6. （关键步骤）要执行系统流量测试，请选择 Desired Pump 并按照作软件中描述的步骤进行作。验证系统流量是否流向转子流量计。此校准是为了确保系统中没有泄漏。如果系统未通过流速测试，请在重新尝试测试之前清洁组件和管路。
7. Cancel 会提示开始数据记录，除非准备好开始实验。

2. 创建 Puff 配置文件

1. 创建 2 L/min 的偏置流曲线，以确保在整个实验过程中受试者有足够的曝气。为此，请参阅制造商提供的外部文档中的技术说明 037：创建配置文件的指南。
2. 为电子烟配置文件创建一个 puff。为此，请参阅技术说明 037。在此处描述的方案中，技术说明经过修改，可提供 78 mL 的喷吹体积，喷吸持续时间为 2.4 秒，喷吸速度为 1、2 或 4 喷/分钟，如之前发布的 12,13,14,15,16,17。

3. 动物准备

1. 对于该方案，使用雄性和雌性 C57BL/6 小鼠，年龄为 10-12 周，体重约为 20-30 克。在 3 天内逐渐使小鼠适应该系统。
   1. 将小鼠置于软约束内开始驯化，然后在与它们的实验暴露时间相匹配的时间内用室内空气以 2 L/min 开始偏压流。使用 10 分钟、20 分钟或 30 分钟的驯化期来匹配此处描述的实验曝光。采取这些步骤是为了尽量减少应激对感兴趣结局的任何影响。
   2. 要将动物置于软约束中，请完全缩回网格组件，将整个约束装置保持在动物面前，然后等待动物移动到柱塞组件中。
   3. 确认动物的鼻子在约束装置的柱塞组件中可见，然后将活页夹固定在动物后面，以防止任何脱离约束装置的移动。
      注意：年龄较小、体型较小的动物可以在约束装置内更轻松地纵，因此必须验证它们的鼻子在柱塞组件外部是否仍然可见。
2. 当与不同性别或基因型的小鼠一起工作时，请考虑使用颜色编码的活页夹来区分动物。

4. 动物的暴露

1. 将 6 只被束缚的动物放在暴露系统的仅鼻子塔中，并用室内空气以 2 L/min 的速度启动偏置流，以确保足够的气流。
2. 在屏幕右侧的任务泊坞窗中，右键单击 E-cigarette Profile Created，然后选择 Task Properties。
3. 在 Puff Frequency 下，输入启动吹吸所需的频率。例如，2 puff/min 的方案需要 30 s 的输入。单击 OK，然后单击 Yes 当软件要求确认此更改时。要保存此 puff 机制以备将来使用，请在会话结束时按照提示将其保存为模板。
4. 准备好执行曝光后，双击已创建且现已修改的 电子烟配置文件。请务必启动计时器来跟踪曝光时间。
5. 为了评估增加曝光长度的剂量，以 10 次/分钟的速度进行 20 分钟和 30 分钟的曝光。然后，为了评估增加的曝光强度，保持 10 分钟的曝光时间，并将抽吸频率增加到 1 吸/分钟、2 吸/分钟和 4 吸/分钟。
6. 曝光完成后，重新启动偏压流，同时将动物放回笼子。
7. 要从约束装置中取出动物，请拆下活页夹并将网片完全缩回柱塞，让动物自行离开约束装置。如果动物仍然处于约束装置中，请轻轻拉动它的尾巴，以示意它可以自由地从约束装置中向后移动。

5. 运动不足测试

1. 暴露后，立即将动物转移到行为测试套件中，以使用 ANY-Maze 软件进行旷场测试。要对动物行为进行基线记录，请确保它们仅暴露在偏流中。
2. 确保房间光线充足，并尽量减少噪音水平，以防止对动物造成不必要的压力，因为这可能会影响它们的行为。
3. 打开软件并选择 New Empty Experiment （新建空实验）。在屏幕顶部的 Protocol 选项卡下，选择 Add item，然后从下拉列表中单击 New Video Source 以添加要用于实验的摄像机源。
4. 在屏幕左侧菜单的 Tracking 部分下，选择 Apparatus 以定义将放置动物的开阔区域。
5. 在协议选项卡下，选择 矩形工具 绘制开阔的田野区域并将其尺寸输入到软件中。
6. 在屏幕左侧菜单的 Tracking 部分下，选择 Animal Color 以指定动物是比背景更亮还是更暗。此信息有助于软件准确跟踪动物的运动。
7. 在左侧菜单中的 Testing 部分下，选择 Stages 以指定实验的测试持续时间。输入 60 秒的测试持续时间。
8. 在 Experiment 选项卡下，定义实验处理和每个处理的动物数量。
9. 现在，要执行测试，请单击 Tests 选项卡。将动物放入空地中，然后单击空地记录上方的 绿色播放按钮 以开始测试。
10. 测试完成后，在左侧菜单中的 Analysis and Results 部分下，选择 Results， Reports， and Data ，然后选择 Total Distance traveled 以将此信息包含在报告中。
11. 要生成报告，请单击 Results 选项卡，然后以所需格式导出数据。

6. 血清样本的采集

1. 暴露后 30 分钟，腹膜内注射 250 mg/kg Avertin （2,2,2-三溴乙醇） 麻醉动物。为确保适当的麻醉，使用钝钳捏住脚趾之间的皮肤，刺激踏板撤退反射。一旦反射完全消失，动物就会被深度麻醉，以便通过心脏穿刺放血来安乐死。选择 30 分钟的时间点以达到暴露后血清 THC-COOH 浓度的峰值¹⁸。
2. 通过在采血管中心脏穿刺收集血液，然后以 10,000 x g 离心 10 分钟以分离血清。
3. 根据制造商的说明和之前发布的¹⁹，使用血清样本进行 THC 法医 ELISA 以量化 THC-COOH 水平。

结果

最初的目标是确定一种暴露制度，与人类相比，该制度可以将生理相关水平的 THC 输送到血液中。因此，选择暴露参数的一个关键组成部分是使用模仿人类使用模式的特征^20,21。雄性和雌性 C57BL/6 小鼠以 1 次喷吹/分钟的速度暴露于含有 ~85% THC 的 Pineapple Express Pax Era Pod 中 10 分钟、20 分钟和 30 分钟，喷吹体积为 78 mL，喷吸持续时间为 2.4 秒。暴露后 30 分钟处死小鼠以测量 THC-COOH 水平。THC-COOH 是 THC²² 的次生代谢物。在小鼠中，血清 THC 在暴露后立即达到峰值，随后被 CYP450 酶羟基化形成 11-OH-THC，后者被迅速氧化为 THC-COOH^23,24。然后 THC-COOH 在血清中积累，在暴露后约 30 分钟达到峰值浓度，为检测提供可靠的标志物¹⁸。血清 THC-COOH 浓度低于空气暴露小鼠的检测限，但在暴露于 THC vape 产品 10 分钟、20 分钟和 30 分钟的小鼠中显着增加到约 11.2 ng/mL、15.2 ng/mL 和 16.1 ng/mL（图 2A）。然后，通过增加每分钟输送的抽吸次数来改变曝光强度，同时在 10 分钟的曝光时间内保持所有其他参数相同。在这里，以 1、2 和 4 吸/分钟的速度暴露于 THC vape 产品的小鼠血清 THC-COOH 显着增加到约 11.4 ng/mL、21.8 ng/mL 和 25.2 ng/mL（图 2B）。在 10 分钟、2 口/分钟和 4 口/分钟暴露方案中达到的 THC-COOH 水平近似于人类大麻使用者吸入后血清中发现的 THC-COOH 水平^{22、25、26、27、28}。

在确定了一种向小鼠提供生理相关大麻素剂量的暴露方案后，下一步是确认该方案也会引发显着的行为结果。为了评估这一点，进行了低运动测试，因为它是 tetrad 测定的一个组成部分，通常用于评估啮齿动物对 THC 的行为反应²⁹。仅暴露于偏流空气的小鼠的基线测量导致 3.41 m 的位移。以 2 口/分钟的速度暴露于 10 分钟的 THC vape 产品后，位移显着降低至 0.29 m，在 4 口/分钟时，位移进一步降低至 0.05 m（图 3）。小鼠的位移在 2 次 puffs/min 和 4 puffs/min 暴露之间没有显着差异。因此，已选择用于未来研究的 2 吸/分钟暴露方案 10 分钟，因为它倾向于小鼠在暴露后更平稳地恢复，同时继续提供生理相关剂量。

图 1：系统描述。 （A） 确保设备组装正确，包括适用于特定设备的吹嘴、干净的管道以及流向仅鼻暴露塔的准确系统流向。 （B） 确保缓冲液室包含封闭管以防止泄漏，如俯视图中的箭头所示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：接触 THC 电子烟产品后的血清 THC-COOH 水平。 共有 6 只小鼠暴露于含有 85% THC 的 THC 电子烟产品中。暴露后 30 分钟，收集血清，通过 THC ELISA 定量 THC-COOH 水平。图表表示 （A） 以 1 口/分钟暴露 10 分钟、20 分钟或 30 分钟后或 （B） 以 1、2 或 4 口/分钟暴露 10 分钟后的 THC-COOH 水平。结果表示为 SEM ±平均值。数据点代表个体小鼠。虚线表示检测限。使用单因素方差分析 （ANOVA） 来确定显著性，使用 Tukey 的多重比较测试检查组间差异（*p = 0.0348;**p = 0.0022;****p < 0.0001 与暴露在空气中的小鼠相比）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：接触 THC 电子烟产品后的运动减退测试。 总共 6 只小鼠暴露于偏流空气中 10 分钟，然后转移到空地进行低运动试验。完成基线测量后，小鼠以 2 口/分钟或 4 口/分钟的浓度暴露 10 分钟。暴露后立即进行第二次运动不足测试。测试持续时间为 60 s。结果表示为 SEM ±平均值。数据点代表个体小鼠。使用单因素方差分析 （ANOVA） 来确定显着性，使用 Tukey 的多重比较检验 （****p < 0.0001） 检查组间差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

大麻馏出物 vape 产品含有高浓度的大麻素，包括本协议中使用的产品高达 85% 的 THC。由于大麻花目前仅达到 36% 的 THC⁷，因此大麻馏出物电子烟产品的效力在开发吸入暴露模型时提出了挑战。目的是确定一种暴露方案，该方案可以有效地向小鼠输送相关剂量的大麻素，而不会因过量的 THC 暴露水平而造成不利影响。

可供购买的大麻产品种类繁多，这使得研究之间的比较复杂;然而，选择具有相似 THC 效力的产品可以提高可重复性。虽然粉扑参数适用于各种产品，但使用效力较低的产品可能需要长时间暴露以确保可重复性，并验证所输送的全身剂量。此外，重要的是要注意这项研究同时暴露了六只小鼠。例如，以 2 口/分钟的速度暴露 10 分钟分布在 6 只小鼠身上，这意味着改变每次暴露的小鼠数量可能会影响接受的个体剂量。在未来使用类似设备进行的研究中，透明地报告每次暴露的动物数量至关重要，因为它可能会显着影响每只动物接受的有效剂量，从而影响研究的总体结果。此外，尽管努力开发复制人类使用模式的粉扑曲线，但重要的是要注意，暴露的小鼠并没有完全吸入产生的每一次粉扑。很大一部分气溶胶被释放到周围环境中。因此，验证暴露后输送到体循环中的剂量对于数据的最终解释至关重要。此外，气溶胶监测技术，例如在暴露系统中加入专门的聚四氟乙烯 （PFTE） 过滤器以捕获气溶胶颗粒，可用于评估颗粒沉积^30,31。暴露后，可以使用液相色谱-质谱法 （LC-MS） 提取和定量沉积在这些过滤器上的 THC 含量³²。此外，可以使用激光衍射³³ 测量粒度。通过整合气溶胶浓度、颗粒大小和小鼠呼吸参数（如潮气量和呼吸频率）的数据，可以使用计算剂量学模型更准确地估计理论吸入剂量 34,35,36。

在吸入研究中，使用两种主要的暴露方式：全身暴露和仅鼻暴露。在全身暴露中，动物不受约束，允许整个体表与测试大气接触³⁷。这种方法的一个缺点是测试剂可能会沉积在毛皮上，当动物梳理自己时可能会摄入毛皮，从而引入意外的暴露途径³⁸。这可以通过使用仅鼻吸入塔来避免。但是，仅鼻子曝光也有局限性。约束动物会增加压力，而某些约束会损害体温调节³⁹。当与较大的动物群体一起工作时，这种方法也可能变得劳动密集型。为了减轻这些因素并避免混淆结果，必须将对照动物放在暴露塔内的约束装置中，仅接收偏置气流。

这里提出的是一个标准化暴露剂量，与人类相比，它达到了大麻素的生理相关水平。该基线测量为研究人员通过修改抽吸频率和暴露持续时间来确定特定实验需求所需的有效剂量，从而探索较低和较高暴露剂量的影响奠定了基础。未来的研究旨在比较各种商业产品和设备，并使用此处描述的方案评估它们的呼吸影响。鉴于呼吸研究人员经常使用 C57BL/6 和 Balb/c 小鼠，因此确定此处介绍的研究结果是否适用于 Balb/c 小鼠以指导未来的研究也很重要。此外，该方案的拟议剂量适用于调查大麻馏出物 vape 产品的急性或慢性影响的扩展研究，为严格的安全性评估提供了机会。鉴于暴露途径是吸入，因此必须彻底了解这些产品对肺部的影响。研究慢性暴露如何影响肺力学、组织驻留免疫细胞的功能和对疾病的易感性，可以初步了解它们对肺生理学的影响。此外，对这些产品的长期影响的担忧不仅限于肺部，还延伸到其他器官。例如，人们对强效 THC 电子烟暴露对大脑的慢性影响仍然知之甚少;然而，慢性 THC 暴露与认知障碍、成瘾和大脑结构改变有关 40,41,42,43。此外，鉴于这些产品在年轻人中的受欢迎程度，它们对大脑发育的潜在影响值得调查。随着大麻市场的持续增长，追求这些终点将非常重要，并且需要进行研究以调查新产品的安全性。这一点至关重要，因为它有助于更好地了解大麻的影响，并有助于确保全球数百万大麻消费者的安全。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-5G	Avertin
inExpose	SCIREQ	sales@scireq.com	www.scireq.com
Microtainer Serum Separator Tubes	BD	365967
Pax Era Vape Pen	PAX		Purchased from Ontario Cannabis Store
Pineapple Express Pax Pod	Good Supply		Purchased from Ontario Cannabis Store
SoftRestraints	SCIREQ	IX-XN1-SR-AL	www.scireq.com
THC Forensic ELISA Kit	Neogen	131019