פיתוח מודל אינהלציה פרה-קליני לבדיקת תזקיקי קנאביס מאודים

Summary

מחסניות אידוי תזקיקי קנאביס הן מכשירים המופעלים על ידי סוללות המרססים תמציות המכילות ריכוזים גבוהים של קנבינואידים. היעדר מודלים פרה-קליניים מבוססים למוצרים אלה יוצר אתגרים בחקר ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם. כדי להתמודד עם הפער הזה, פותח מודל עכברי אינהלציה פרה-קליני סטנדרטי לתזקיקי קנאביס מאודים.

Abstract

למרות הפופולריות הגוברת שלהם, מוצרי אידוי קנאביס נותרו לא נחקרים. מחסניות אידוי קנאביס משמשות עם מכשירים המופעלים על ידי סוללות המרססים תמציות פרחי קנאביס המכילות ריכוזים גבוהים של קנבינואידים כגון THC. סוגים אלה של מוצרים ידועים בדרך כלל כתזקיקי קנאביס. העוצמה של מוצרים אלה מציבה אתגרים בקביעת מינון יעיל למחקרים פרה-קליניים. נכון לעכשיו, אין מודלים פרה-קליניים מבוססים וסטנדרטיים לבדיקת הבטיחות והיעילות של מוצרים אלה בדרכים אנלוגיות לדפוסי שימוש אנושיים. לפיכך, משטר החשיפה לתזקיקי קנאביס in vivo הנדרש להשגת מינונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בהשוואה למה שהושג בבני אדם נותר בלתי מוגדר. כדי להתמודד עם פער זה, פותח מודל עכברי פרה-קליני סטנדרטי לשאיפת תזקיקי קנאביס מאודים באמצעות מערכת אספקה מבוקרת מחשב. פרוטוקול זה מפרט נהלים למתן תזקיקי אדי קנאביס באמצעות טופוגרפיה של נשיפה לעכברים על ידי מגדל חשיפה לאף בלבד. ניתנות גם שיטות לניטור תוצאות התנהגותיות של עכברים לאחר חשיפה ושימוש ב-ELISA כמותי למחצה כדי לאשר את אספקת ה-THC למחזור הדם המערכתי. פרוטוקול זה יאפשר לחקור את התגובות הריאתיות והמערכתיות למוצרי תזקיק קנאביס על ידי חוקרים המעוניינים לחקור את ההשפעה של אידוי קנאביס באמצעות פרוטוקולי אספקה בעולם האמיתי, ובכך לספק הזדמנות לבטיחות קפדנית והערכה טיפולית.

Introduction

עם הלגליזציה של קנאביס המתרחשת ברחבי העולם, השימוש בקנאביס הולך וגובר. שינויים משמעותיים בשוק הקנאביס הקמעונאי לא רק מגבירים את הנגישות, אלא גם מניעים את הפיתוח והייצור של סוגים חדשים של מוצרי קנאביס לצריכה¹. מכשירי אידוי, המחממים מוצרי קנאביס ללא בעירה, הופכים לשיטת צריכה פופולרית יותר ויותר ^2,3. מכשירי האידוי כוללים מחסניות אידוי קנאביס המשתמשות בטכנולוגיית סיגריות אלקטרוניות כדי לחמם ולרסס תזקיקי קנאביס. תזקיקים אלו מופקים מפרח הקנאביס סאטיבה כדי לייצר נוזל צמיג עם ריכוזים גבוהים של קנבינואידים כגון Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC), המרכיב הפסיכואקטיבי העיקרי של קנאביס⁴. מכשירים אלה קלים לשימוש ולהסתרה, מה שהופך אותם לאטרקטיביים למשתמשים מתחילים⁵. בקנדה, שם הקנאביס אושר למטרות פנאי בשנת 2018, נתוני הסקר שהתקבלו מראים עלייה בקבלה החברתית הנתפסת של אידוי קנאביס וכן עלייה משמעותית בשימוש בעט/מחסנית קנאביס⁶.

צרכני קנאביס עשויים להאמין כי אידוי תזקיקי קנאביס בטוח יותר מעישון הפרח המיובש בצורת ג'וינט, מה שתורם לפופולריות הגוברת שלו². למרות ההפחתה האפשרית בחשיפה למוצרי בעירה בשאיפה בעת שימוש בתזקיקי קנאביס, ייתכן שמוצרים אלה אינם נטולי סיכון. חשש אחד הוא החשיפה למינונים גבוהים של קנבינואידים הנמצאים במחסניות אידוי מסחריות. ניתן לרכוש את פרח הקנאביס המיובש עם עד 36% THC, בעוד שריכוז ה- THC במחסניות תזקיקי קנאביס יכול להגיע עד 96%⁷. אירוסולים ממחסניות תזקיקי קנאביס מכילים בערך פי שניים מריכוזי THC בהשוואה לעשן קנאביס ^8,9. עדיין לא ידוע אילו השפעות יש לריכוזי THC גבוהים אלה על דרכי הנשימה. יתר על כן, הריכוזים הגבוהים של THC מספקים אתגרים בקביעת מינון יעיל למחקרים פרה-קליניים בעכברים, שכן חשיפה מוגזמת ל-THC עצמה עלולה להיות בעלת השפעות שליליות על עכברים¹⁰. חיוני להתחיל ברמות חשיפה מינימליות ולהגדיל בהדרגה עד להשגת מינונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כדי להבטיח שחשיפות אלו רלוונטיות.

נכון להיום, אין מחקרים הבוחנים את ההשפעות הפוטנציאליות של תזקיקי קנאביס מאודים בשאיפה. זה נובע בחלקו מהיעדר מודלים פרה-קליניים סטנדרטיים קיימים. אתגרי המחקר מורכבים באזורים שבהם מוצרים אלה נותרים בלתי חוקיים, מה שמניע חוקרים לייצר תזקיקים פנימיים שאולי אינם משקפים במדויק מוצרים מסחריים¹¹. בנוסף, המגוון הרחב של המוצרים הזמינים מסבך את הסטנדרטיזציה. כדי לגשר על הפער הזה, מחקר זה החל באמצעות מוצרים חוקיים וזמינים מסחרית הנגישים לצרכנים קנדיים. מוצרים ומכשירים הרשומים כמוכרים ביותר בחנות הקנאביס של אונטריו נבחרו לשימוש. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס משטר חשיפה קל לשימוש לעכברים המספק מינוני THC דומים לרמות אנושיות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, וליצור בסיס לחוקרים לערוך מחקרים נוספים על ההשפעות הנשימתיות והמערכתיות של תזקיקי קנאביס מאודים.

Protocol

ההליכים שלהלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל (פרוטוקול מספר 8087) בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC).

1. הכנת ציוד

הערה: הפרוטוקול הבא חל על מערכת SCIREQ inExpose הנתמכת על-ידי תוכנת flexiWare 8.

1. ודא את ההרכבה הנכונה של כל רכיבי המערכת כדי להידמות למשלampהמוצג באיור 1A. ודא שיש צינור סגור המוחדר לתא החיץ של משאבת הנשיפה כדי למנוע דליפת מערכת, כפי שמוצג באיור 1B.
2. הפעל את המערכת והפעל את התוכנה. בחר את המודול מפגשי ניסוי .
3. בחר מחקר חדש והגדר את קבוצות הניסוי והנושאים שיש ללמוד. בחר את תבנית הניסוי המתאימה למשטר החשיפה הרצוי.
4. בחלון מאפייני הפעלה, השלם את המקטע אופרטור כדי לעקוב אחר השימוש בציוד.
5. כדי לבצע כיול, בחר את הערוץ הרצוי ובצע את השלבים המתוארים בתוכנת ההפעלה.
6. (שלב קריטי) כדי לבצע את בדיקת זרימת המערכת, בחר את המשאבה הרצויה ובצע את השלבים המתוארים בתוכנת ההפעלה. ודא שזרימת המערכת מכוונת לכיוון מד הסיבוב. כיול זה נועד להבטיח שאין דליפה במערכת. אם המערכת לא עוברת את מבחן הזרימה, נקה את הרכיבים והצינורות לפני שתנסה שוב את הבדיקה.
7. בטל הנחיות להתחיל בהקלטת נתונים אלא אם כן מוכן להתחיל בניסוי.

2. יצירת פרופילי פאף

1. צור פרופיל זרימת הטיה של 2 ליטר לדקה כדי להבטיח אוורור הולם של הנבדקים לאורך כל הניסוי. לשם כך, עיין ב-Technote 037: מדריך ליצירת פרופילים במסמך חיצוני הזמין מהיצרן.
2. צור נשיפה לפרופילי סיגריות אלקטרוניות. לשם כך, עיין ב-Technote 037. בפרוטוקול המתואר כאן, ה-technote שונה כדי לספק נפח נשיפה של 78 מ"ל, עם משך נשיפה של 2.4 שניות, ו-1, 2 או 4 שאיפות לדקה כפי שפורסם בעבר 12,13,14,15,16,17.

3. הכנת בעלי חיים

1. השתמש בעכברי C57BL/6 זכרים ונקבות, בגילאי 10-12 שבועות ובמשקל של כ-20-30 גרם לפרוטוקול זה. אקלום עכברים למערכת בהדרגה במשך 3 ימים.
   1. התחל את ההתאקלמות עם מיקום העכברים בתוך הריסון הרך, ולאחר מכן התחל בזרימת הטיה ב-2 ליטר לדקה עם אוויר בחדר לאורך תקופה שתתאים לאורך החשיפה הניסיונית שלהם. השתמש בתקופת הסתגלות של 10 דקות, 20 דקות או 30 דקות כדי להתאים לחשיפות הניסיוניות המתוארות כאן. צעדים אלה ננקטו כדי למזער את כל ההשפעות הנגרמות על ידי לחץ על תוצאות מעניינות.
   2. כדי למקם בעלי חיים במעצורים רכים, החזירו את רכיב הרשת במלואו, החזיקו את כל הריסון מול החיה והמתינו עד שהחיה תעבור לרכיב הבוכנה.
   3. ודא שהאף של החיה נראה ברכיב הבוכנה של הריסון, ולאחר מכן אבטח קליפ קלסר ממש מאחורי החיה כדי למנוע כל תנועה מחוץ לריסון.
      הערה: בעלי חיים צעירים וקטנים יותר יכולים לתמרן ביתר קלות בתוך הריסון, ולכן חיוני לוודא שהאף שלהם נשאר גלוי מחוץ לרכיב הבוכנה.
2. כשאתה עובד עם עכברים ממינים או גנוטיפים שונים, שקול להשתמש בקליפס קלסר מקודד בצבע כדי להבחין בין בעלי חיים.

4. חשיפת בעלי חיים

1. הנח שישה בעלי חיים מרוסנים במגדל האף בלבד של מערכת החשיפה והתחל את זרימת ההטיה במהירות של 2 ליטר לדקה עם אוויר בחדר כדי להבטיח זרימת אוויר מספקת.
2. במעגן המשימות בצד ימין של המסך, לחץ לחיצה ימנית על פרופיל הסיגריה האלקטרונית שנוצר ולאחר מכן בחר מאפייני משימה.
3. תחת תדירות נשיפה, הזן את התדר הרצוי להתחלת נשיפה. לדוגמה, משטר של 2 שאיפות לדקה דורש קלט של 30 שניות. לחץ על אישור ולאחר מכן על כן כאשר התוכנה מבקשת אישור לשינוי זה. כדי לשמור את משטר הנשיפה הזה לשימוש עתידי, בסוף ההפעלה עקוב אחר ההנחיות כדי לשמור אותו כתבנית.
4. כאשר תהיה מוכן לבצע את החשיפה, לחץ פעמיים על פרופיל הסיגריה האלקטרונית שנוצר והשתנה כעת. הקפד להפעיל טיימר כדי לעקוב אחר אורך החשיפה.
5. כדי להעריך את המינון על פני אורכי חשיפה הולכים וגדלים, בצע חשיפות של 10 דקות, 20 דקות ו-30 דקות בשאיפה אחת לדקה. לאחר מכן, כדי להעריך את עוצמת החשיפה הגוברת, שמור על אורך חשיפה של 10 דקות והגדל את תדירות הנשיפה ל-1 שאיפות לדקה, 2 שאיפות לדקה ו-4 שאיפות לדקה.
6. לאחר השלמת החשיפה, התחל מחדש את זרימת ההטיה תוך החזרת בעלי החיים לכלובים שלהם.
7. כדי להסיר בעלי חיים מהמעצורים, נתק את תפס הקלסר והחזיר את הרשת במלואה לבוכנה, מה שמאפשר לבעל החיים לצאת מהריסון בכוחות עצמו. אם בעל החיים נשאר בריסון, משוך בעדינות את זנבו כדי לאותת שהוא חופשי לנוע לאחור מחוץ לריסון.

5. מבחן היפו-תנועה

1. מיד לאחר החשיפה, העבירו את בעלי החיים לחבילת בדיקות התנהגותיות לביצוע בדיקה בשטח פתוח באמצעות תוכנת ANY-Maze. כדי לבצע הקלטות בסיסיות של התנהגות בעלי חיים, ודא שהם חשופים רק לזרימת הטיה.
2. ודא שהחדר מואר היטב ומזער את רמות הרעש כדי למנוע לחץ מיותר על בעלי החיים, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על התנהגותם.
3. פתח את התוכנה ובחר ניסוי ריק חדש. תחת הכרטיסייה פרוטוקול בחלק העליון של המסך, בחר הוסף פריט ולאחר מכן לחץ על מקור וידאו חדש מהרשימה הנפתחת כדי להוסיף את מקור המצלמה שישמש לניסוי.
4. בתפריט בצד שמאל של המסך, תחת הקטע מעקב, בחר מכשיר כדי להגדיר את השדה הפתוח בו תוצב החיה.
5. תחת הכרטיסייה פרוטוקול, בחר בכלי המלבן כדי לצייר את אזור השדה הפתוח ולהזין את מידותיו לתוכנה.
6. בתפריט בצד שמאל של המסך, תחת המקטע מעקב, בחר צבע בעלי חיים כדי לציין אם החיה בהירה או כהה יותר מהרקע. מידע זה מסייע לתוכנה לעקוב במדויק אחר תנועת החיה.
7. בתפריט הימני, תחת הקטע בדיקה, בחר שלבים כדי לציין את משך הבדיקה עבור הניסוי. הזן משך בדיקה של 60 שניות.
8. תחת הכרטיסייה ניסוי, הגדירו את הטיפול הניסיוני ואת מספר בעלי החיים בכל טיפול.
9. כעת, כדי לבצע את הבדיקה, לחץ על הכרטיסייה בדיקות . הנח את החיה בשדה הפתוח, ולחץ על כפתור ההפעלה הירוק מעל ההקלטה של השדה הפתוח כדי להתחיל את הבדיקה.
10. עם סיום הבדיקה, בתפריט הימני, תחת המקטע ניתוח ותוצאות, בחר תוצאות, דוחות ונתונים ובחר מרחק כולל שנסע כדי לכלול מידע זה בדוח.
11. כדי להפיק את הדוח, לחץ על הכרטיסייה תוצאות וייצא את הנתונים בתבנית הרצויה.

6. איסוף דגימות סרום

1. 30 דקות לאחר החשיפה, יש להרדים בעלי חיים עם זריקה תוך-צפקית של 250 מ"ג/ק"ג אברטין (2,2,2-טריברומו-אתנול). כדי להבטיח הרדמה נכונה, עורר את רפלקס נסיגת הדוושה על ידי צביטת העור בין אצבעות הרגליים באמצעות מלקחיים קהים. לאחר שהרפלקס נעלם לחלוטין, החיה מורדמת עמוק מספיק כדי לעבור המתת חסד על ידי ניקור לב. נקודת הזמן של 30 דקות נבחרה כדי להשיג ריכוזי שיא של THC-COOH בסרום לאחר החשיפה¹⁸.
2. אסוף דם על ידי ניקור לב בצינורות איסוף דם, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להפריד את הסרום.
3. השתמש בדגימות סרום כדי לבצע THC Forensic ELISA כדי לכמת את רמות ה-THC-COOH בהתאם להוראות היצרן וכפי שפורסם בעבר¹⁹.

תוצאות

המטרה הראשונית הייתה לקבוע משטר חשיפה שיוכל לספק רמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית של THC לדם בהשוואה לבני אדם. לפיכך, מרכיב מרכזי בבחירת פרמטרי חשיפה היה שימוש בתכונות המחקות דפוסי שימוש אנושיים^20,21. עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות נחשפו לתרמיל Pineapple Express Pax Era המכיל ~85% THC למשך 10 דקות, 20 דקות ו-30 דקות בשאיפה אחת לדקה עם נפח נשיפה של 78 מ"ל ומשך נשיפה של 2.4 שניות. עכברים הוקרבו 30 דקות לאחר החשיפה כדי למדוד את רמות ה-THC-COOH. THC-COOH הוא מטבוליט משני של THC²². בעכברים, THC בסרום מגיע לשיא מיד לאחר החשיפה ולאחר מכן עובר הידרוקסילציה על ידי אנזימי CYP450 ליצירת 11-OH-THC, שמתחמצן במהירות ל-THC-COOH^23,24. לאחר מכן THC-COOH מצטבר בסרום, ומגיע לריכוזי שיא כ-30 דקות לאחר החשיפה, ומספק סמן אמין לזיהוי¹⁸. ריכוזי THC-COOH בסרום היו מתחת לגבול הזיהוי בעכברים שנחשפו לאוויר, אך עלו באופן משמעותי לכ-11.2 ננוגרם/מ"ל, 15.2 ננוגרם/מ"ל ו-16.1 ננוגרם/מ"ל בעכברים שנחשפו לתוצר האידוי THC במשך 10 דקות, 20 דקות ו-30 דקות, בהתאמה (איור 2A). לאחר מכן, עוצמת החשיפות השתנתה על ידי הגדלת מספר השאיפות המועברות לדקה תוך שמירה על כל שאר הפרמטרים זהים במהלך זמן חשיפה של 10 דקות. כאן, THC-COOH בסרום עלה באופן משמעותי לכ-11.4 ננוגרם/מ"ל, 21.8 ננוגרם/מ"ל ו-25.2 ננוגרם/מ"ל בעכברים שנחשפו למוצר אידוי THC ב-1, 2 ו-4 שאיפות לדקה, בהתאמה (איור 2B). רמות ה-THC-COOH שהושגו במשטרי החשיפה של 10 דקות, 2 שאיפות לדקה ו-4 שאיפות לדקה מתקרבות לרמות ה-THC-COOH שנמצאו בסרום של משתמשי קנאביס אנושיים לאחר שאיפה 22,25,26,27,28.

לאחר זיהוי משטר חשיפה שסיפק מינוני קנבינואידים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לעכברים, השלב הבא היה לאשר שמשטר זה יביא גם לתוצאות התנהגותיות משמעותיות. כדי להעריך זאת, בוצעה בדיקת היפו-תנועה, מכיוון שהיא מרכיב של מבחן הטטראד המשמש בדרך כלל להערכת תגובות התנהגותיות ל-THC במכרסמים²⁹. מדידות בסיסיות בעכברים שנחשפו רק לאוויר זרימת הטיה הביאו לתזוזה של 3.41 מ'. לאחר חשיפה ל-10 דקות של מוצר אידוי THC ב-2 שאיפות לדקה, התזוזה הופחתה משמעותית ל-0.29 מ', וב-4 שאיפות לדקה, היא הופחתה עוד יותר ל-0.05 מ' (איור 3). לא היה הבדל משמעותי בתזוזה של העכברים בין 2 השאיפות לדקה ל-4 שאיפות לדקה. לפיכך, משטר החשיפה של 2 שאיפות לדקה למשך 10 דקות נבחר לשימוש במחקרים עתידיים מכיוון שהוא נוטה לקראת התאוששות חלקה יותר עבור העכברים לאחר החשיפה תוך המשך מתן מינונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

איור 1: תיאור המערכת. (א) ודא שהציוד מורכב כהלכה, כולל הפיה המתאימה למכשיר הספציפי, צינורות נקיים וכיוון זרימת מערכת מדויק לכיוון מגדל החשיפה לאף בלבד. (ב) ודא שתא החיץ מכיל צינור סגור למניעת דליפה, כפי שצוין על ידי החץ בתצוגה העליונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: רמות THC-COOH בסרום לאחר חשיפה למוצר vape THC. בסך הכל שישה עכברים נחשפו למוצר אידוי THC המכיל 85% THC. 30 דקות לאחר החשיפה, נאסף סרום כדי לכמת את רמות ה-THC-COOH על ידי THC ELISA. גרפים מייצגים את רמות ה-THC-COOH לאחר חשיפה של (A) של 10, 20 או 30 דקות ב-1 שאיפה/דקה או (B) לאחר חשיפה של 10 דקות ב-1, 2 או 4 שאיפות לדקה. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM. נקודות נתונים מייצגות עכברים בודדים. הקו המקווקו מייצג את גבול הזיהוי. נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) כדי לקבוע מובהקות, כאשר ההבדלים בין הקבוצות נבדקו באמצעות מבחני ההשוואה המרובים של טוקי (*p = 0.0348; **p = 0.0022; ****p < 0.0001 בהשוואה לעכברים שנחשפו לאוויר). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: בדיקת היפו-תנועה לאחר חשיפה למוצר vape THC. בסך הכל שישה עכברים נחשפו לאוויר זרימת הטיה למשך 10 דקות ואז הועברו לשדה פתוח לביצוע בדיקת היפו-תנועה. עם השלמת המדידות הבסיסיות, עכברים נחשפו לחשיפה של 10 דקות ב-2 שאיפות לדקה או 4 שאיפות לדקה. בדיקת היפו-תנועה שנייה נערכה מיד לאחר החשיפה. משך הבדיקה היה 60 שניות. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM. נקודות נתונים מייצגות עכברים בודדים. נעשה שימוש בניתוח שונות חד כיווני (ANOVA) לקביעת מובהקות, כאשר ההבדלים בין הקבוצות נבדקו באמצעות מבחני ההשוואה המרובים של טוקי (****p < 0.0001).  אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מוצרי אידוי תזקיקי קנאביס מכילים ריכוזים גבוהים של קנבינואידים, כולל עד 85% THC עבור המוצר המשמש בפרוטוקול זה. מכיוון שפרח הקנאביס מגיע כיום רק ל-36% THC⁷, העוצמה של מוצרי אידוי תזקיקי קנאביס מספקת אתגרים בעת פיתוח מודל לחשיפה לשאיפה. המטרה הייתה לקבוע משטר חשיפה שיוכל לספק ביעילות מינונים רלוונטיים של קנבינואידים לעכברים מבלי לגרום לתופעות לוואי מרמות חשיפה מוגזמות ל-THC.

המגוון הרחב של מוצרי קנאביס הזמינים לרכישה מסבך את ההשוואות בין המחקרים; עם זאת, בחירת מוצרים עם עוצמת THC דומה מקדמת את יכולת השחזור. בעוד שפרמטרי הנשיפה ניתנים להתאמה למוצרים שונים, השימוש במוצרים בעלי עוצמה נמוכה יותר עשוי לדרוש חשיפות ממושכות כדי להבטיח שחזור, יחד עם אימות המינון המערכתי שנמסר. בנוסף, חשוב לציין שמחקר זה חשף שישה עכברים בו זמנית. לדוגמה, חשיפה של 10 דקות ב-2 שאיפות לדקה מחולקת על פני שישה עכברים, כלומר שינוי מספר העכברים בכל מפגש חשיפה יכול להשפיע על המינון האישי שהתקבל. דיווח שקוף על מספר בעלי החיים בכל חשיפה חיוני במחקרים עתידיים המשתמשים בציוד דומה, מכיוון שהוא יכול להשפיע באופן משמעותי על המינון האפקטיבי שמקבל כל בעל חיים וכתוצאה מכך על התוצאות הכוללות של המחקר. בנוסף, למרות המאמצים לפתח פרופילי נשיפה המשכפלים דפוסי שימוש אנושיים, חשוב לציין שהעכברים החשופים אינם שואפים במלואם כל נשיפה המיוצרת. חלק ניכר מהתרסיס משתחרר לסביבה שמסביב. לכן, אימות המינון המועבר למחזור הדם המערכתי לאחר החשיפה הוא קריטי לפרשנות הסופית של הנתונים. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקות ניטור אירוסול, כגון שילוב מסנני פוליטטרפלואורואתילן מיוחדים (PFTE) בתוך מערכת החשיפה כדי ללכוד חלקיקי אירוסול, כדי להעריך שקיעת חלקיקים^30,31. לאחר החשיפה, ניתן לחלץ ולכמת את תכולת ה-THC המופקדת על מסננים אלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS)³². בנוסף, ניתן למדוד את גודל החלקיקים באמצעות עקיפה בלייזר³³. על ידי שילוב נתונים על ריכוז אירוסול, גודל חלקיקים ופרמטרים נשימתיים של עכברים כגון נפח גאות ותדירות נשימה, ניתן להעריך מינונים תיאורטיים בשאיפה בדיוק רב יותר באמצעות מודלים של דוזימטריה חישובית 34,35,36.

במחקרי אינהלציה נעשה שימוש בשתי שיטות חשיפה עיקריות: חשיפה לכל הגוף וחשיפה לאף בלבד. בחשיפות לכל הגוף, בעלי החיים אינם מרוסנים, מה שמאפשר לכל פני הגוף לבוא במגע עם אטמוספירת הניסוי³⁷. החיסרון של שיטה זו הוא הפוטנציאל של חומרי בדיקה להצטבר על הפרווה, שעלול להיבלע כאשר החיה מטפחת את עצמה, ומציגה מסלול חשיפה לא מכוון³⁸. ניתן להימנע מכך על ידי שימוש במגדל שאיפה לאף בלבד. עם זאת, לחשיפות לאף בלבד יש גם מגבלות. ריסון בעלי חיים יכול להגביר את הלחץ, ומעצורים מסוימים עלולים לפגוע בוויסות החום³⁹. גישה זו יכולה גם להיות אינטנסיבית בעבודה כאשר עובדים עם קבוצות גדולות יותר של בעלי חיים. במאמצים להפחית את הגורמים הללו ולהימנע מתוצאות מבלבלות, חיוני להציב חיות ביקורת במעצורים בתוך מגדל החשיפה, ולקבל רק זרימת אוויר מוטה.

מוצע כאן מינון חשיפה סטנדרטי שמשיג רמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית של קנבינואידים בהשוואה לבני אדם. מדידה בסיסית זו מבססת בסיס לחוקרים לחקור את ההשפעות של מינוני חשיפה נמוכים וגבוהים יותר על ידי שינוי תדירות הנשיפה ומשך החשיפה כדי לקבוע את המינון האפקטיבי הרצוי לצרכי ניסוי ספציפיים. מחקרים עתידיים שואפים להשוות בין מוצרים ומכשירים מסחריים שונים ולהעריך את ההשפעות הנשימתיות שלהם באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. בהתחשב בכך שחוקרי נשימה משתמשים לעתים קרובות בעכברי C57BL/6 ו-Balb/c, חיוני גם לקבוע אם הממצאים המוצגים כאן ישימים לעכברי Balb/c כדי להנחות מחקר עתידי. בנוסף, המינון המוצע של הפרוטוקול מתאים למחקרים מורחבים החוקרים השפעות חריפות או כרוניות של מוצרי אידוי תזקיקי קנאביס, ומספק הזדמנות להערכת בטיחות קפדנית. בהתחשב בכך שמסלול החשיפה הוא שאיפה, חיוני להבין היטב את ההשפעות של מוצרים אלה על הריאות. חקירת האופן שבו חשיפות כרוניות משפיעות על מכניקת הריאות, תפקודם של תאי מערכת החיסון השוכנים ברקמות ורגישות למחלות יכולה לספק הבנה ראשונית של השפעתם על פיזיולוגיה של הריאות. בנוסף, החששות לגבי ההשפעות ארוכות הטווח של מוצרים אלה מתרחבים מעבר לריאות לאיברים אחרים. לדוגמה, ההשפעות הכרוניות של חשיפה חזקה לאדי THC על המוח נותרו לא מובנות היטב; עם זאת, חשיפה כרונית ל-THC נקשרה לפגיעה קוגניטיבית, התמכרות ושינויים מבניים במוח 40,41,42,43. יתר על כן, בהתחשב בפופולריות של מוצרים אלה בקרב בני נוער, השפעתם הפוטנציאלית על התפתחות המוח מצדיקה חקירה. המרדף אחר נקודות הקצה הללו יהיה חשוב ככל ששוק הקנאביס ימשיך לצמוח, ויש צורך במחקר כדי לחקור את הבטיחות של מוצרים חדשים. זה חיוני מכיוון שהוא תורם להבנה משופרת של השפעות הקנאביס ומסייע להבטיח את בטיחותם של מיליוני צרכני קנאביס ברחבי העולם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-5G	Avertin
inExpose	SCIREQ	sales@scireq.com	www.scireq.com
Microtainer Serum Separator Tubes	BD	365967
Pax Era Vape Pen	PAX		Purchased from Ontario Cannabis Store
Pineapple Express Pax Pod	Good Supply		Purchased from Ontario Cannabis Store
SoftRestraints	SCIREQ	IX-XN1-SR-AL	www.scireq.com
THC Forensic ELISA Kit	Neogen	131019