用于聚糖分析的小胶质细胞线粒体制备

摘要

开发了一种方案，用于从小胶质细胞制备纯化的线粒体，分离线粒体蛋白以释放 N-糖，以及使用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离与高分辨率精确质量分析仪质谱联用快速检测亚细胞线粒体聚糖。

摘要

了解小胶质细胞中线粒体蛋白的糖基化模式对于确定它们在神经退行性疾病中的作用至关重要。在这里，我们提出了一种新颖的高通量方法，用于对从培养的小胶质细胞中分离的线粒体蛋白进行糖组分析。该方法包括从小胶质细胞培养物中分离线粒体，对线粒体样品进行质量评估，然后进行优化的蛋白质提取以最大限度地提高聚糖检测能力，以及红外基质辅助激光解吸电喷雾电离 （IR-MALDESI） 高分辨率精确质量 （HRAM） 质谱法，以提供线粒体糖基化的详细概况。

该方案强调了在分离过程中保持线粒体完整性的重要性，并采用严格的质量控制来确保可重复性，包括在提取后测量线粒体纯度。这种方法允许在 体外各种实验条件下全面分析小胶质细胞线粒体中的糖基化变化，从而深入了解与神经退行性疾病相关的线粒体变化。这种方法可以适用于其他 体外 处理、其他培养细胞类型或原代细胞。通过这种标准化方法，我们的目标是促进对小胶质细胞线粒体聚糖的理解，为更广泛的神经退行性研究领域做出贡献。

引言

小胶质细胞是大脑中占主导地位的先天免疫细胞，占成人大脑细胞的 10-15% ^1,2。他们使用自己的受体库来动态监测大脑微环境并调节正常的大脑功能以维持大脑稳态³。小胶质细胞对其微环境的变化非常敏感，并在病理条件或各种刺激下经历细胞形态、免疫表型和功能的变化。小胶质细胞激活状态受其功能所需的细胞能量需求的影响，例如吞噬作用、细胞因子产生或组织修复。因此，细胞能量代谢在调节小胶质细胞功能的变化中起着至关重要的作用⁴。小胶质细胞失调导致促炎细胞因子（例如 IL-1β、TNF-α）和活性氧 （ROS） 的过度释放，使大脑易发生神经炎症 ^5,6。慢性小胶质细胞失调和由此产生的神经炎症环境为神经退行性变奠定了基础⁷。

大脑只占体重的 2%，但占身体总能量消耗的 20%。线粒体是脑细胞的主要能量来源，在急性和慢性脑部疾病的发病机制中起着关键作用⁸。以前的研究已经确定了⁹ 岁和阿尔茨海默病等年龄相关疾病中小胶质细胞活化与代谢功能障碍之间的强相关性^10,11，^强调了线粒体在细胞衰老和神经退化中的关键作用。线粒体功能受损会导致衰老和年龄相关疾病期间能量产生减少、氧化应激升高以及神经炎症增加。

虽然广泛的研究已经阐明了线粒体在能量代谢、衰老和脑部疾病中的作用，但常见的翻译后修饰（如糖基化）在线粒体生物学和功能中的作用仍未得到充分探索。糖基化，即糖基化酶促将称为聚糖的糖基团酶促加成到蛋白质上，是大多数脑细胞（包括小胶质细胞）中最常见的翻译后修饰。活化的小胶质细胞通过调节细胞内或细胞表面聚糖表达，在炎症刺激下调节其免疫功能¹²。小胶质细胞刺激后表现出的促炎和抗炎反应也受聚糖调节¹³。线粒体蛋白也具有这些聚糖修饰，可调节它们的功能和定位。然而，由于研究亚细胞糖基化的技术挑战，缺乏对小胶质细胞中细胞特异性线粒体糖基化模式的详细分析。尽管糖基化在调节小胶质细胞表型中的作用已得到充分表征，但聚糖在调节线粒体功能以及随后的作用中，小胶质细胞中的细胞免疫表型仍然知之甚少。

调查线粒体蛋白糖基化的有限研究主要集中在基于凝集素的糖基化模式鉴定上。凝集素是结合生物分子聚糖部分^14,15 的聚糖结合蛋白，缺乏提供有关聚糖组成详细信息的特异性和能力。质谱模式提供了聚糖组成的详细鉴定，以克服凝集素分析带来的分析挑战。其中一种模式是红外基质辅助激光解吸电喷雾电离 （IR-MALDESI），它采用混合电离策略，使用中红外激光共振激发生物样本¹⁶ 中发现的水，以解吸中性物质并使其受到正交电喷雾羽流的影响，然后使用高分辨率精确质量 Orbitrap 质谱仪进行分析。IR-MALDESI 先前已被证明可用于组织代谢物的直接分析¹⁷，具有快速分析¹⁸、软电离法以及基于氯化聚糖加合物同位素分布模式的 N-连接聚糖唾液酸含量的可预测性¹⁹ 的明显优势。然而，该平台用于直接分析亚细胞聚糖的适应性尚未得到证实。

在这里，我们报道了一种从小胶质细胞中分离线粒体、分离线粒体 N-聚糖以及使用 IR-MALDESI 质谱法进行线粒体 N-聚糖检测和分析的高通量方案。该协议将是揭示糖基化在线粒体功能中的作用的新见解的基础，有可能确定神经炎症和神经退行性疾病的新治疗靶点。

研究方案

1. BV2 小胶质细胞系培养

1. 将 BV-2 细胞（源自 C57BL/6 小鼠的小胶质细胞）维持在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉菌-链霉素 （PenStrep） 和 1% 非必需氨基酸 （NEAA） 的 DMEM 低葡萄糖培养基中。
2. 在 T-175 培养瓶中培养细胞，并使其达到 70-80% 汇合。
3. 通过在 37 °C 下在 5% CO₂ 中与细胞解离酶孵育 5 分钟来分裂细胞，然后用等体积的细胞培养基灭活酶，并在室温 （RT） 下以 500 × g 离心细胞 5 分钟。
   注：此处使用的细胞解离酶对 BV2 细胞比胰蛋白酶更温和，可用于保护细胞表面抗原表达。
4. 吸出培养基，将细胞沉淀重悬于 1 mL 生长培养基中，并使用台盼蓝对细胞进行计数（参见 材料表）。
   注意：我们在此步骤中使用了自动细胞计数器来计数细胞。
5. 要进行线粒体分离，如果细胞沉淀包含 2 × 10⁷ （2000 万个细胞/沉淀），则继续进行。

2. 从小胶质细胞中分离线粒体

注意：快速工作，在整个过程中保持所有物品都在冰上。用于线粒体分离的线粒体分离试剂盒具有三个组分：试剂 A（细胞裂解缓冲液）、试剂 B（稳定缓冲液）和试剂 C（线粒体洗涤缓冲液）。临用前向试剂 A 和试剂 C 中加入蛋白酶抑制剂。

1. 通过在 2.0 mL 微量离心管中以 500 × g 离心收获的细胞 5 分钟，将收获的细胞沉淀 2 × 10⁷ 个细胞。小心吸出并丢弃上清液。
2. 加入 800 μL 线粒体分离试剂 A（细胞裂解缓冲液），以中速涡旋 5 秒，然后将试管在冰上孵育 2 分钟。
   注意：孵育时间不要超过 2 分钟。
3. 加入 10 μL 线粒体分离试剂 B（稳定缓冲液），以最大速度涡旋 5 秒，并将试管在冰上孵育 5 分钟，每分钟以最大速度涡旋。
4. 加入 800 μL 线粒体分离试剂 C（线粒体洗涤缓冲液），倒置试管数次混合，并在 4 °C 下以 700 × g 离心试管 10 分钟。
   注意：请勿涡旋。
5. 将上清液转移到新的 2.0 mL 试管中，并在 4 °C 下以 3,000 × g 旋转 15 分钟。
6. 将上清液（胞质部分）转移到新管中。该颗粒包含分离的线粒体。
7. 向沉淀中加入 500 μL 线粒体分离试剂 C，并以 12,000 × g 离心 5 分钟。
8. 使用沉淀进行蛋白质定量和加工，或将沉淀储存在 -80 °C 直至进一步使用。

3. 使用 microBCA 测定法进行蛋白质估计

注：可以使用不同的试剂和测定法进行该方案的蛋白质估计。细胞溶质或线粒体蛋白的定量可以通过对测定中使用的总蛋白浓度进行归一化来进行。

1. 制备 0 μg/mL 至 200 μg/mL（0 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、200 μg/mL）的牛血清白蛋白 （BSA） 标准品和仅含裂解缓冲液的空白。
2. 将 150 μL 每种标准品添加到装有样品的平底 96 孔板中。
3. 将 25 份微量 BCA 试剂 MA（二辛可宁酸 （BCA） 溶液）和 24 份试剂 MB（硫酸铜溶液）与 1 份试剂 MC（稳定缓冲液）（25：24：1，试剂 MA：MB：MC）混合，制成工作试剂。向每个样品和标准品中加入 150 μL 混合 BCA 试剂。
4. 在 37 °C 下孵育 2 小时。
5. 使用读板器测量 562 nm 处的吸光度，并用标准曲线定量蛋白质浓度。从所有其他单个标准品和未知样品重复的吸光度测量值中减去空白标准品吸光度，以获得样品蛋白质浓度。

4. 线粒体制备质量控制（western blot）

1. 将线粒体沉淀重悬于放射免疫沉淀测定缓冲液 （RIPA） 缓冲液中以进行蛋白质定量。使用 micro BCA 测定法测定每个样品的蛋白质浓度。
2. 将样品在 94 ^°C 的样品缓冲液中变性 5 分钟。
3. 将等量 （20 μg） 的线粒体蛋白连同分子量标记一起加载到预制凝胶中（参见 材料表）。
4. 在 100 V 下运行凝胶 50 分钟。
   注：电泳时间可能会有所不同，因此请确保在蛋白质到达样品缓冲液中染料指示的凝胶末端时停止凝胶。
5. 在 western 印迹转移系统中，使用干转印方案将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上，在 20 V 下 7 分钟。
6. 取出膜，在室温下使用封闭溶液（表 1）封闭 1 小时。
7. 在 4 ^oC 下，在封闭缓冲液中将适当稀释的一抗添加到膜中过夜（COXIV= 1：3,000，GAPDH = 1：3,000）。
   注：线粒体制备物中不存在核、内质网 （ER） 污染，可以通过在蛋白质印迹中使用其他标记物（如核纤层蛋白标记物）和 ERp57（ER 标记物）来检测。
8. 用洗涤缓冲液洗涤膜 3 x 15 分钟（表 1）。
9. 在封闭缓冲液中，将膜与适当稀释的 HRP 偶联二抗在封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时
10. 用洗涤缓冲液洗涤膜 3 x 15 分钟。
11. 对于显影，请使用化学发光底物试剂盒。
12. 使用凝胶和膜成像仪扫描膜。

5. 线粒体蛋白分离用于从小胶质细胞中提取 N-糖

1. 将分离的线粒体重悬于 50 μL 蛋白质分离缓冲液（表 1）中，并在冰上放置 20 分钟。
2. 吸出并分配 3 次，然后在冰上放置 20 分钟（使用前涡旋）。如果线粒体沉淀未完全溶解，则再加入 50 μL 分离缓冲液并合并到同一管中。
3. 以 13,000 × g 离心 10 分钟。
4. 回收上清液，在 -80 ^oC 下冷冻至少 1 小时，并在真空浓缩器中尽可能多地干燥。
5. 在使用 IR-MALDESI 的 PNGase 消化缓冲液（表 1）进行游离寡糖分离之前重悬。

6. 用于 IR-MALDESI 的线粒体 N -糖制备

1. 将 25-250 μg 分离的线粒体蛋白的蛋白质（最大体积为 250 μL）加载到 10 kDa 截留分子量 （MWCO） 过滤器上。
2. 向过滤器中的每个样品中添加 2 μL 1 M 二硫苏糖醇 （DTT），减少蛋白质样品以暴露聚糖部分。
3. 用 200 μL PNGase 消化缓冲液稀释样品并轻轻涡旋以避免干扰过滤器。
4. 通过将样品在 56 °C 下孵育 30 分钟来使线粒体蛋白变性。
5. 使用 50 μL 1 M 碘乙酰胺对线粒体进行烷基化，得到 ~200 mM 的最终浓度，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
6. 为了进一步浓缩变性线粒体方法，将样品以 14,000 × g 离心 40 分钟。丢弃流通件。
7. 用 100 μL PNGase 消化缓冲液洗涤样品。
8. 将糖蛋白以 14,000 × g 的浓度浓缩在过滤器上 20 分钟，然后弃去流出物。重复洗涤和浓缩步骤 2 次，总共 3 倍，在过滤器死体积 （~5 μL） 中产生浓缩物。丢弃所有流出物。
9. 洗涤完成后丢弃收集瓶。对于所有将来的洗脱液和清洗液，请使用新的收集瓶。
10. 要从变性线粒体糖型中切割聚糖，转移至新的收集瓶中，并向过滤器中加入 2 μL 不含甘油的 PNGase（75,000 单位/mL）。加入 98 μL PNGase 消化缓冲液，使总体积达到 100 μL，并在过滤器上轻轻上下吹打混合。
11. 将样品在 37 °C 下孵育 18 小时，以酶促切割线粒体蛋白中的所有 N-糖。
12. 通过在 20 °C 下以 14,000 × g 离心样品 20 分钟来洗脱释放的线粒体 N-聚糖。
13. 向过滤器中加入 100 μL PNGase 消化缓冲液洗涤线粒体聚糖，并在 20 °C 下以 14,000 × g 离心 20 分钟。 将含有任何剩余 N-糖的洗涤液收集在与洗脱液相同的收集瓶中。重复 2 次并从收集瓶中取出过滤器。
14. 将线粒体聚糖样品在 -80 °C 冰箱中孵育直至冷冻（30-60 分钟），并在室温下在真空浓缩器中干燥至完成（400 μL 为 4-6 小时）。
    注： 分析前，N-糖可在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
15. 在 IR-MALDESI 分析之前，将干燥的 N-连接糖直接重悬于 50 μL LC/MS 级水中。

7. 通过 IR-MALDESI 质谱法检测释放的游离寡糖

1. 实验的每一天都进行质量校准。将校准溶液加载到注射泵上，并以 1.2 μL/min 的速率推入。施加 3.5 kV 的电压，以获得稳定的电喷雾羽流，以便在正负模式下进行质量校准。
2. 将 5 μL 重悬的线粒体聚糖移液到 Teflon 微孔载玻片上的样品点上。
3. 使用波长为 2.97 μm 的中红外激光器进行烧蚀，每次脉冲的能量为 1.8 mJ。
4. 在负电离模式下电离并检测 N-糖。使用由 60% 乙腈和 1 mM 乙酸组成的电喷雾溶剂，在 3.2 kV 电压下产生流速为 2 μL/min 的稳定电喷雾羽流。
5. 为了进行分析，将 IR-MALDESI 与设置为 240,000_FWHM 质量分辨能力（m /z 200）的 HRAM 质谱仪耦合，在负电离模式下分析 500 至 2,000 m/z 。
6. 关闭自动增益控制 （AGC） 并设置 90 ms 的固定进样时间。使用 EasyIC 离子源对每个谱图进行实时内部校准，以实现高质量测量精度 （MMA）。

8. 线粒体 N- 糖数据分析

1. 通过搜索单同位素质量数并使用 m/z 间距确认同位素分布来手动鉴定 N-连接聚糖，以确定最小离子通量阈值为 1,000 个离子/秒的双电荷和三电荷离子。
2. 将原始质谱从 m/z 比率转换为中性单同位素质量。
3. 将单同位素质量上传到在线寡糖结构预测工具，以确定潜在的聚糖组成。使用实验整理的糖组数据库确认注释²⁰;确保每次鉴定都在 2.5 ppm MMA 的范围内，包含核心 N-连接聚糖结构（十六进制₃HexNAc₂），并不包括戊糖、KDN 或 HexA 单糖。
4. 使用 SNFG 命名法²¹ 绘制已确认的聚糖结构。
5. 从原始质谱获得游离寡糖的相对丰度，并针对线粒体蛋白的量（以 μg 为单位）进行归一化，以获得 ions/s/μg。
6. 使用卡方分析来检验 N-连接聚糖的理论分布和实验分布之间的拟合优度，以确定氯加合物的数量。这允许直接测定唾液酸的数量¹⁹.

结果

图 1 显示了从 BV2 小胶质细胞系中分离线粒体以进行质谱聚糖分析所涉及的步骤的示意图。 图 2 表示了来自小胶质细胞相同起始密度的不同线粒体制剂之间线粒体蛋白分离的可重复性，这表明使用微 BCA 测定法估计的线粒体蛋白浓度之间没有显着差异。

图 3 表示使用 COX IV 和 GAPDH 的?...

讨论

小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，聚糖修饰调节小胶质细胞的免疫表型和功能。这些免疫功能需要大量的细胞能量，而细胞能量主要由线粒体提供。值得注意的是，线粒体蛋白还存在聚糖修饰，由于研究亚细胞糖基化的技术挑战，这些修饰仍未得到充分研究。大多数调查线粒体糖基化的研究都依赖于基于凝集素的聚糖模式鉴定²²，尽管这些方法受到凝?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Amersham 600 imager	Cytvia	29194217	Gel and membrane imager
Countess 3 automated cell counter	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V	Thermofisher scientific	88870003
i-Blot2 Gel Transfer Device	Invitrogen	IB21001	Western blot transfer system
Inverted microscope	Cell Treat	04355223EA
Microplate reader		82050-760
Mini gel tank	Invitrogen	A25977
Open Air Rocker	Fisher Brand	88861025
Pipet boy	BioTek	229310
Vortex mixer	Integra- VWR
Mitochondria isolation reagents
Mitochondrial Isolation kit	Thermofisher scientific	89874
Phosphotase Inhibitor	Thermofisher scientific	1861274
Protease Inhibitor	Thermofisher scientific	1861281
N-glycan isolation and IR-MALDESI reagents
Acetic acid	Fisher Scientific	A11350	50% in ESI solvent
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM in ESI solvent
Ammonium bicarbonate	Fisher Scientific	A643500	100 mM
Calibration Solution	Thermofisher Scientific	A39239	Pierce FlexMix
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A322-10VL
LC/MS grade water	Thermofisher Scientific	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL, enzyme for N-glycan release
N-glycan isolation and IR-MALDESI consumables
Amicon centrifugal filters	Fisher Scientific	UFC501024	10 kDa MWCO
Mass spectrometer	Orbitrap Exploris 240
Mid-IR Laser	JGM Associates, Burlington, MA, USA
Teflon microwell slide	Prosolia, Indianapolis, IN, USA
N-glycan analysis softwares
GlycoMod	Expasy		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy		https://glyconnect.expasy.org/
Protein isolation and western blot consumables
Basix gel loading tips ( 10 µL)	Basix	13-611-102
Basix gel loading tips ( 200 µL)	Basix	13-611-116
Cell scrapper	VWR labs	14-388-100
i-Blot NC regular stacks	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF Regular Stacks	Invitrogen	IB24001
10  µL micropipette	Fisher Scientific	FBE00010
20 µL micropipette	Invitrogen	FBE00020
200  µL micropipette	Fisher Brand	FBE00200
1000 µL micropipette	Fisher brand	FBE01000
10  µL pipet tips	VWR labs	76322-528
20  µL pipet tips	VWR labs	76322-134
200  µL pipet tips	VWR labs	76322-150
1000  µL pipet tips	VWR labs	76322-154
Well plate	Fisher brand	14-388-100
Protein isolation and western blot reagents
Actin antibody ( Host : Rabbit )	Cell Signaling Technologies	8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked	Cell Signaling Technologies	7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
Bovine Serum Albumin	Fisher bioreagents	BP9700-100
COXIV antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	4844S
GAPDH antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	2118S
MicroBCA protein assay Kit	Thermofisher scientific	23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]	Thermofisher scientific	NP0001
PAGE Ruler prestained protein ladder	Thermofisher scientific	815-968-0747	Dilution= Use 7  µL to load onto first well
Phosphate buffered saline	Aniara Diagnostics	A12-9423-5	Prepare 1x PBS from 10x powder
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermofisher scientific	32106	Chemiluminescent substrate kit
RIPA Buffer	Thermofisher scientific	89901
Sample Buffer	Novex	B0007	The bolt LDS sample buffer is prepared in 3:1 ratio of sample to sample buffer
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
Tissue culture consumables
Countess Slides	Avantor	229411
Eppendorf tubes	Cell Treat	414004-265612-5884
2 mL aspirating pipet	Vista lab	5090-0010E
5 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11D
10 mL serological pipet	Basix	13-678-11E
25 mL serological pipet	Vista lab	FB012937
50 mL serological pipet	Vista lab	14955233
15 mL Conical tube	Avantor	229225A
50 mL conical tube	Cell treat	4190-0050
T-75 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012937
T-180 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012939
Tissue culture reagents
BV2 microglial cell line	Creative Bioarray	CSC-I2227Z	Immortalized Mouse Microglia (BV2) derived from C57/BL6 neonatal microglia
Cell dissociation enzymes	Thermofisher scientific	12563029	TrypLE
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Low Glucose Media	Gibco	10567014
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30071.03HI
Minimum Essential Medium (MEM) Non-essential Amino Acids	Gibco	11140050
Penicillium Streptomycin	Cytivia	SV30010
Phosphate buffer saline	Corning	21-040-CV
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282