Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse

Zusammenfassung

Es wurde ein Protokoll für die Präparation gereinigter Mitochondrien aus Mikrogliazellen, die Isolierung mitochondrialer Proteine für die Freisetzung von N-Glykanen und den schnellen Nachweis subzellulärer, mitochondrialer Glykane mittels Infrarot-Matrix-unterstützter Laserdesorptions-Elektrospray-Ionisation in Verbindung mit hochauflösender präziser Massenanalysator-Massenspektrometrie entwickelt.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Glykosylierungsmuster mitochondrialer Proteine in Mikroglia ist entscheidend für die Bestimmung ihrer Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen. Hier stellen wir eine neuartige Hochdurchsatz-Methodik für die glykomische Analyse von mitochondrialen Proteinen vor, die aus kultivierten Mikroglia isoliert wurden. Diese Methode umfasst die Isolierung von Mitochondrien aus Mikrogliakulturen, die Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, gefolgt von einer optimierten Proteinextraktion zur Maximierung der Glykandetektion, und die hochauflösende genaue Massenspektrometrie (IR-MALDESI) mit Infrarotmatrix-unterstützter Laserdesorptions-Elektrospray-Ionisation (IR-MALDESI), um detaillierte Profile der mitochondrialen Glykosylierung zu erhalten.

Dieses Protokoll unterstreicht die Bedeutung der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Integrität während der Isolierung und setzt strenge Qualitätskontrollen ein, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, einschließlich der Messung der mitochondrialen Reinheit nach der Extraktion. Dieser Ansatz ermöglicht ein umfassendes Profiling von Glykosylierungsänderungen in mikroglialen Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in vitro, was einen Einblick in mitochondriale Veränderungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bietet. Dieser Ansatz könnte an andere in vitro-Behandlungen , andere kultivierte Zelltypen oder Primärzellen angepasst werden. Durch diesen standardisierten Ansatz wollen wir das Verständnis der mitochondrialen Glykane der Mikroglia vorantreiben und so einen Beitrag zum breiteren Feld der neurodegenerativen Forschung leisten.

Einleitung

Mikroglia sind die dominierenden angeborenen Immunzellen im Gehirn und machen 10-15% der Zellen im erwachsenen Gehirn aus ^1,2. Sie nutzen ihr Rezeptorrepertoire, um die Mikroumgebung des Gehirns dynamisch zu überwachen und die normale Gehirnfunktion zu regulieren, um die Homöostase des Gehirns aufrechtzuerhalten³. Mikroglia reagieren sehr empfindlich auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung und verändern die Zellmorphologie, den Immunphänotyp und die Funktion bei pathologischen Zuständen oder verschiedenen Stimulationen. Die Aktivierungszustände der Mikroglia werden durch den zellulären Energiebedarf beeinflusst, der für ihre Funktion erforderlich ist, wie z. B. Phagozytose, Zytokinproduktion oder Gewebereparatur. Daher spielt der zelluläre Energiestoffwechsel eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Veränderungen der Mikrogliafunktion⁴. Eine mikrogliale Dysregulation führt zu einer übermäßigen Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen (z. B. IL-1β, TNF-α) und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), wodurch das Gehirn für Neuroinflammation prädisponiert^{wird 5,6}. Eine chronische Dysregulation der Mikroglia und das daraus resultierende neuroinflammatorische Milieu legen den Grundstein für die Neurodegeneration⁷.

Das Gehirn macht nur 2 % des Körpergewichts, aber 20 % des gesamten Energieverbrauchs des Körpers aus. Mitochondrien sind die primäre Energiequelle in den Gehirnzellen und spielen eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese sowohl akuter als auch chronischer Hirnerkrankungen⁸. Frühere Studien haben eine starke Korrelation zwischen der Aktivierung von Mikroglia und metabolischer Dysfunktion im Alter⁹ und altersbedingten Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit^10,11 festgestellt, was die zentrale Rolle der Mitochondrien bei der zellulären Seneszenz und Neurodegeneration hervorhebt. Eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion führt zu einer verminderten Energieproduktion, erhöhtem oxidativem Stress und vermehrter Neuroinflammation während des Alterns und altersbedingter Krankheiten.

Während umfangreiche Forschungen die Rolle der Mitochondrien beim Energiestoffwechsel, beim Altern und bei Erkrankungen des Gehirns aufgeklärt haben, ist die Rolle gängiger posttranslationaler Modifikationen, wie z. B. der Glykosylierung, in der Biologie und Funktion der Mitochondrien noch unzureichend erforscht. Die Glykosylierung, die enzymatische Addition von Zuckereinheiten, den sogenannten Glykanen, an Proteine durch Glykosylierungsenzyme, ist die häufigste posttranslationale Modifikation in den meisten Gehirnzellen, einschließlich Mikroglia. Aktivierte Mikroglia modulieren ihre Immunfunktion unter Entzündungsreizen, indem sie die Glykanexpression auf der Zelloberfläche regulieren¹². Die pro- und antiinflammatorischen Reaktionen der Mikroglia-Nachstimulation werden ebenfalls durch die Glykane reguliert¹³. Mitochondriale Proteine weisen ebenfalls diese Glykanmodifikationen auf, die ihre Funktion und Lokalisation regulieren. Eine detaillierte Analyse der zellspezifischen mitochondrialen Glykosylierungsmuster in den Mikroglia fehlt jedoch aufgrund der technischen Herausforderungen bei der Untersuchung der subzellulären Glykosylierung. Trotz der gut charakterisierten Rolle der Glykosylierung bei der Modulation des Mikroglia-Phänotyps ist die Rolle der Glykane bei der Modulation der mitochondrialen Funktion und damit des zellulären Immunphänotyps bei Mikroglia nach wie vor wenig verstanden.

Begrenzte Studien, die die Glykosylierung mitochondrialer Proteine untersuchten, konzentrierten sich hauptsächlich auf die lektinbasierte Identifizierung von Glykosylierungsmustern. Lektine sind Glykan-bindende Proteine, die biomolekulare Glykaneinheiten^{binden 14,15}, denen die Spezifität und Fähigkeit fehlt, detaillierte Informationen über die Glykanzusammensetzung zu liefern. Massenspektrometrische Modalitäten bieten eine detaillierte Identifizierung der Glykanzusammensetzungen, um die analytischen Herausforderungen der Lektinanalyse zu bewältigen. Eine solche Modalität, die infrarot-matrixgestützte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisation (IR-MALDESI), verwendet eine hybride Ionisationsstrategie, bei der ein mittlerer IR-Laser verwendet wird, um das in biologischen Proben¹⁶ gefundene Wasser resonant anzuregen, um die neutrale Spezies zu desorbieren und sie einer orthogonalen Elektrosprayfahne auszusetzen, gefolgt von einer Analyse unter Verwendung eines hochauflösenden, präzisen Massen-Orbitrap-Massenspektrometers. IR-MALDESI wurde bereits für die direkte Analyse von Gewebemetaboliten¹⁷ demonstriert, mit deutlichen Vorteilen der Schnellanalyse¹⁸, der weichen Ionisationsmethode und der Vorhersagbarkeit des Sialinsäuregehalts von N-verknüpften Glykanen auf der Grundlage der Isotopenverteilungsmuster von chlorierten Glykanaddukten¹⁹. Die Adaption dieser Plattform für die direkte Analyse subzellulärer Glykane wurde jedoch nicht demonstriert.

In dieser Arbeit berichten wir über ein Hochdurchsatzprotokoll für die mitochondriale Isolierung aus Mikrogliazellen, die Isolierung von mitochondrialen N-Glykanen und den Nachweis und die Analyse von mitochondrialen N-Glykanen mittels IR-MALDESI-Massenspektrometrie. Dieses Protokoll wird grundlegend sein, um neue Erkenntnisse über die Rolle der Glykosylierung in der mitochondrialen Funktion zu gewinnen und möglicherweise neue therapeutische Ziele für neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu identifizieren.

Protokoll

1. BV2 Mikroglia-Zelllinien-Kultur

1. Halten Sie die BV-2-Zellen (Mikrogliazellen, die von C57BL/6-Mäusen abgeleitet sind) in DMEM-Medien mit niedrigem Glukosegehalt, die mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillium-Streptomycin (PenStrep) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) ergänzt werden.
2. Züchten Sie die Zellen in T-175-Kolben und lassen Sie sie eine Konfluenz von 70-80 % erreichen.
3. Die Zellen werden gespalten, indem sie 5 Minuten lang bei 37 °C in 5 % CO₂ mit den Zelldissoziationsenzymen inkubieren, gefolgt von einer Inaktivierung der Enzyme mit dem gleichen Volumen an Zellmedien und 5 Minuten lang bei 500 × g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
   HINWEIS: Die hier verwendeten Zelldissoziationsenzyme sind schonender für BV2-Zellen als Trypsin und können zum Schutz der Antigenexpression auf der Zelloberfläche verwendet werden.
4. Aspirieren Sie das Medium, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Wir haben für diesen Schritt einen automatischen Zellzähler verwendet, um Zellen zu zählen.
5. Um die mitochondriale Isolierung durchzuführen, gehen Sie vor, wenn das Zellpellet 2 × 10⁷ (20 Millionen Zellen/Pellet) enthält.

2. Isolierung von Mitochondrien aus Mikrogliazellen

HINWEIS: Arbeiten Sie schnell und halten Sie während des gesamten Vorgangs alles auf Eis. Das mitochondriale Isolationskit, das für die mitochondriale Isolierung verwendet wird, besteht aus drei Komponenten: Reagenzien A (Zelllysepuffer), Reagenz B (stabilisierender Puffer) und Reagenz C (mitochondrialer Waschpuffer). Unmittelbar vor der Anwendung Proteaseinhibitoren zu Reagenz A und Reagenz C hinzufügen.

1. Pelletieren Sie 2 × 10⁷ Zellen, indem Sie die geernteten Zellen in einem 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 500 × g für 5 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.
2. Geben Sie 800 μl mitochondriales Isolationsreagenz A (Zelllysepuffer) hinzu, wirbeln Sie es 5 s lang bei mittlerer Geschwindigkeit vor und inkubieren Sie das Röhrchen genau 2 Minuten lang auf Eis.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Inkubationszeit von 2 Minuten.
3. Fügen Sie 10 μl mitochondriales Isolationsreagenz B (stabilisierender Puffer) hinzu, wirbeln Sie es 5 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vor und inkubieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang auf Eis, wobei Sie jede Minute mit maximaler Geschwindigkeit vortexen.
4. Geben Sie 800 μl Mitochondrien-Isolationsreagenz C (mitochondrialer Waschpuffer) hinzu, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen, und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 700 × g für 10 min bei 4 °C.
   HINWEIS: Nicht wirbeln.
5. Den Überstand in ein neues 2,0-ml-Röhrchen umfüllen und 15 min bei 4 °C bei 3.000 × g schleudern.
6. Übertragen Sie den Überstand (zytosolische Anteile) in ein neues Röhrchen. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien.
7. Geben Sie 500 μl Mitochondrien-Isolationsreagenz C in das Pellet und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 12.000 × g .
8. Verwenden Sie das Pellet zur Proteinquantifizierung und -verarbeitung oder lagern Sie das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.

3. Proteinschätzung mittels microBCA-Assay

HINWEIS: Die Proteinschätzung für dieses Protokoll kann mit verschiedenen Reagenzien und Assays durchgeführt werden. Die Quantifizierung von zytosolischen oder mitochondrialen Proteinen kann durch Normalisierung gegen die im Assay verwendete Gesamtproteinkonzentration erfolgen.

1. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA)-Standards zwischen 0 μg/ml und 200 μg/ml (0 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml, 200 μg/ml) und Blindproben nur mit Lysepuffer vor.
2. Geben Sie 150 μl jedes Standards in die 96-Well-Platte mit flachem Boden, die die Proben enthält.
3. Mischen Sie 25 Teile Micro BCA Reagenz MA (Bicinchoninsäure (BCA)-Lösung) und 24 Teile Reagenz MB (Kupfersulfatlösung) mit 1 Teil Reagenz MC (stabilisierender Puffer) (25:24:1, Reagenzien MA:MB:MC), um ein funktionierendes Reagenz herzustellen. Geben Sie 150 μl des gemischten BCA-Reagenzes zu jeder Probe und jedem Standard.
4. 2 h bei 37 °C inkubieren.
5. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die Extinktion bei 562 nm zu messen und die Proteinkonzentration mit der Standardkurve zu quantifizieren. Subtrahieren Sie die Blanko-Standard-Extinktion von der Absorptionsmessung aller anderen Einzelstandards und unbekannten Probenreplikate, um die Proteinkonzentrationen der Probe zu erhalten.

4. Qualitätskontrolle der mitochondrialen Präparation (Western Blot)

1. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet im RIPA-Puffer (Radioimmunoprecipitation Assay Buffer), um eine Proteinquantifizierung durchzuführen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration für jede Probe mit dem Mikro-BCA-Assay.
2. Die Proben werden 5 Minuten lang in einem Probenpuffer bei 94 ^°C denaturiert.
3. Laden Sie gleiche Mengen (20 μg) mitochondriales Protein zusammen mit dem Molekulargewichtsmarker auf vorgefertigte Gele (siehe Materialtabelle).
4. Lassen Sie das Gel 50 Minuten lang bei 100 V laufen.
   HINWEIS: Die Laufzeit kann variieren, stellen Sie also sicher, dass Sie das Gel stoppen, wenn die Proteine das Ende des Gels erreicht haben, das durch den Farbstoff im Probenpuffer angezeigt wird.
5. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran unter Verwendung des Trockentransferprotokolls in einem Western-Blot-Transfersystem für 7 Minuten bei 20 V.
6. Nehmen Sie die Membran heraus und verschließen Sie sie mit der Blockierlösung (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur.
7. Geben Sie geeignete Verdünnungen des Primärantikörpers in den Blockierungspuffer über Nacht bei 4 ^°C (COXIV = 1:3.000, GAPDH = 1:3.000).
   HINWEIS: Die Abwesenheit einer Kontamination durch nukleares, endoplasmatisches Retikulum (ER) in der mitochondrialen Präparation kann durch die Verwendung zusätzlicher Marker wie Lamin (nukleärer Marker) und ERp57 (ER-Marker) in westlichen Blots getestet werden.
8. Waschen Sie die Membran 3 x 15 min lang mit dem Waschpuffer (Tabelle 1).
9. Inkubieren Sie die Membran mit der entsprechenden Verdünnung von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern in einem Blockpuffer bei Raumtemperatur für 1 h
10. Waschen Sie die Membran 3 x 15 min mit dem Waschpuffer.
11. Verwenden Sie für die Entwicklung ein Chemilumineszenz-Substrat-Kit.
12. Scannen Sie die Membran mit einem Gel- und Membran-Imager.

5. Isolierung von mitochondrialen Proteinen für die N-Glykan-Extraktion aus Mikroglia

1. Die isolierten Mitochondrien in 50 μl Proteinisolationspuffer (Tabelle 1) resuspendieren und 20 Minuten auf Eis ruhen lassen.
2. Dreimal aspirieren und dispensieren und 20 min auf Eis lassen (vor Gebrauch vortexen). Wenn das mitochondriale Pellet nicht vollständig löslich ist, fügen Sie weitere 50 μl des Isolationspuffers hinzu und geben Sie es in dasselbe Röhrchen.
3. Bei 13.000 × g 10 min zentrifugieren.
4. Den Überstand zurückgewinnen, mindestens 1 h bei -80 ^°C einfrieren und so viel wie möglich in einem Vakuumkonzentrator trocknen.
5. Resuspendieren Sie vor der Glykanisolierung mit dem PNGase-Verdauungspuffer (Tabelle 1) für IR-MALDESI.

6. Mitochondriale N-Glykan-Präparation für IR-MALDESI

1. Laden Sie 25-250 μg Protein (in 250 μl maximalem Volumen) isolierter mitochondrialer Proteine auf einen 10 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Filter (MWCO).
2. Reduzieren Sie die Proteinproben, um die Glykananteile freizulegen, indem Sie jeder Probe im Filter 2 μl 1 M Dithiothreitol (DTT) hinzufügen.
3. Verdünnen Sie die Probe mit 200 μl PNGase-Aufschlusspuffer und wirbeln Sie sie leicht auf, um eine Störung des Filters zu vermeiden.
4. Denaturieren Sie die mitochondrialen Proteine, indem Sie die Probe 30 Minuten lang bei 56 °C inkubieren.
5. Verwenden Sie 50 μl 1 M Iodacetamid, um die Mitochondrien zu alkylieren, um eine Endkonzentration von ~200 mM zu erhalten, und inkubieren Sie 60 Minuten lang bei 37 °C.
6. Um die denaturierten mitochondrialen Methoden weiter zu konzentrieren, zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g für 40 Minuten. Verwerfen Sie den Durchfluss.
7. Waschen Sie die Probe mit 100 μl PNGase-Aufschlusspuffer.
8. Konzentrieren Sie das Glykoprotein 20 Minuten lang bei 14.000 × g auf den Filter und verwerfen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Wasch- und Konzentratschritt 2x für insgesamt 3x, bis ein Konzentrat im Totvolumen des Filters (~5 μL) entsteht. Verwerfen Sie den gesamten Durchfluss.
9. Entsorgen Sie das Auffangfläschchen, sobald die Wäschen abgeschlossen sind. Verwenden Sie ein neues Sammelfläschchen für alle zukünftigen Eluenten und Waschungen.
10. Um die Glykane von denaturierten mitochondrialen Glykomustern zu spalten, geben Sie sie in ein frisches Sammelfläschchen und geben Sie 2 μl glycerinfreie PNGase (75.000 Einheiten/ml) in den Filter. Fügen Sie 98 μl PNGase-Aufschlusspuffer hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 100 μl erhöht wird, und mischen Sie, indem Sie den Filter vorsichtig auf und ab pipettieren.
11. Inkubieren Sie die Proben 18 Stunden lang bei 37 °C, um alle N-Glykane enzymatisch von mitochondrialen Proteinen zu spalten.
12. Eluieren Sie die freigesetzten mitochondrialen N-Glykane, indem Sie die Probe 20 Minuten lang bei 20 °C bei 14.000 × g zentrifugieren.
13. Waschen Sie die mitochondrialen Glykane, indem Sie 100 μl PNGase-Aufschlusspuffer in den Filter geben und zentrifugieren Sie ihn bei 14.000 × g für 20 min bei 20 °C. Sammeln Sie die Waschung, die alle verbleibenden N-Glykane enthält, in derselben Durchstechflasche wie das Eluenten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x und entfernen Sie den Filter aus dem Auffangfläschchen.
14. Die mitochondrialen Glykanproben werden im -80 °C-Gefrierschrank inkubiert, bis sie eingefroren sind (30-60 min) und bei Raumtemperatur in einem Vakuumkonzentrator vollständig getrocknet sind (4-6 h für 400 μl).
    HINWEIS: N-Glykane können vor der Analyse bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
15. Resuspendieren Sie die getrockneten N-verknüpften Glykane in 50 μl Wasser in LC/MS-Qualität direkt vor der IR-MALDESI-Analyse.

7. Nachweis von freigesetzten Glykanen mittels IR-MALDESI Massenspektrometrie

1. Führen Sie an jedem Tag des Experiments eine Massenkalibrierung durch. Laden Sie die Kalibrierlösung auf eine Spritzenpumpe und drücken Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 1,2 μl/min durch. Legen Sie eine Spannung von 3,5 kV an, um eine stabile Elektrospray-Wolke für die Massenkalibrierung sowohl im positiven als auch im negativen Modus zu erhalten.
2. Pipettieren Sie 5 μl resuspendierte mitochondriale Glykane auf einen Probenfleck auf einem Teflon-Mikrotiterobjektträger.
3. Verwenden Sie einen Laser im mittleren Infrarotbereich, der bei einer Wellenlänge von 2,97 μm arbeitet, für die Ablation mit einer Energie von 1,8 mJ pro Burst.
4. Ionisieren und detektieren Sie N-Glykane im negativen Ionisationsmodus. Verwenden Sie ein Elektrospray-Lösungsmittel, das aus 60 % Acetonitril und 1 mM Essigsäure besteht, um eine stabile Elektrospray-Wolke mit einer Durchflussrate von 2 μL/min bei einer Spannung von 3,2 kV zu erzeugen.
5. Um die Analyse durchzuführen, koppelt das IR-MALDESI an ein HRAM-Massenspektrometer, das auf ein Massenauflösungsvermögen von 240.000_FWHM bei m/z 200 eingestellt ist, und analysiert zwischen 500 und 2.000 m/z im negativen Ionisationsmodus.
6. Schalten Sie die automatische Verstärkungsregelung (AGC) aus und stellen Sie eine feste Injektionszeit von 90 ms ein. Verwenden Sie die EasyIC-Quelle für die interne Echtzeitkalibrierung jedes Spektrums, um eine hohe Massenmessgenauigkeit (MMA) zu erreichen.

8. Analyse der mitochondrialen N-Glykan-Daten

1. Identifizieren Sie die N-verknüpften Glykane manuell, indem Sie nach monoisotopischen Massen suchen und die Isotopenverteilungen mithilfe des m/z-Abstands bestätigen, um doppelt und dreifach geladene Ionen zu bestimmen, die eine minimale Ionenflussschwelle von 1.000 Ionen/s aufweisen.
2. Konvertieren Sie die Rohmassenspektren von m/z-Verhältnissen in neutrale monoisotopische Massen.
3. Laden Sie die Monoisotopenmassen in ein Online-Tool zur Vorhersage der Oligosaccharidstruktur hoch, um die potenzielle Glykanzusammensetzung zu bestimmen. Bestätigung von Annotationen mit einer experimentell kuratierten Glykomdatenbank²⁰; Stellen Sie sicher, dass jede Identifizierung innerhalb des Bereichs von 2,5 ppm MMA liegt, die N-verknüpfte Kernglykanstruktur (Hex₃HexNAc₂) enthält und Pentose-, KDN- oder HexA-Monosaccharide ausschließt.
4. Zeichnen Sie die bestätigten Glykanstrukturen mit der SNFG-Nomenklatur²¹.
5. Ermitteln Sie die relative Häufigkeit von Glykanen aus den Rohmassenspektren und normalisieren Sie sich gegen die Menge des mitochondrialen Proteins in μg, um Ionen/s/μg zu erhalten.
6. Verwenden Sie die Chi-Quadrat-Analyse, um die Güte der Anpassung zwischen der theoretischen und der experimentellen Verteilung der N-verknüpften Glykane zu testen und die Anzahl der Chloraddukte zu bestimmen. Dies ermöglicht die direkte Bestimmung der Anzahl der Sialinsäuren¹⁹.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die Schritte, die bei der Isolierung von Mitochondrien aus der BV2-Mikrogliazelllinie für die massenspektrometrische Glykananalyse erforderlich sind. Die Reproduzierbarkeit der mitochondrialen Proteinisolierung zwischen verschiedenen mitochondrialen Präparaten aus der gleichen Ausgangsdichte der Mikrogliazellen ist in Abbildung 2 dargestellt, die keinen signifikanten Unterschied zwischen der mitochondrialen Proteinkonzentration zeigt, die mit dem Mikro-BCA-Assay geschätzt wurde.

Abbildung 3 zeigt die Reinheit der mitochondrialen Isolierungen unter Verwendung der Western-Blot-Analyse von COX IV und GAPDH. Hier sehen wir die Expression des mitochondrialen Proteins COX IV in der mitochondrialen Fraktion, die im letzten Schritt der reagenzienbasierten Isolierung isoliert wurde, die im Protokoll verwendet wird. Die Immunoblots zeigen eine prominente COX IV-Bande in der isolierten mitochondrialen Fraktion, während GAPDH nur in der zytoplasmatischen Fraktion bei gleicher Exposition nachgewiesen wird. Längere Belichtungszeiten können zur Detektion einer schwachen GAPDH-Bande führen. Die Expression des nicht-mitochondrialen Markers GAPDH ist im Ganzzelllysat nach Isolierung von Mitochondrien ohne die CoxIV-Banden nachweisbar, was auf eine vollständige Isolierung der mitochondrialen Fraktion und eine minimale nicht-mitochondriale Kontamination hinweist. Die COX IV-Expression in den mitochondrialen Fraktionen ist konsistent zwischen verschiedenen Präparaten mit ähnlicher Ausgangszelldichte von 2 × 10⁷ Zellen.

Repräsentative Massenspektren der freigesetzten N-Glykane, die mit IR-MALDESI in Abbildung 4 nachgewiesen wurden, zeigen das Vorhandensein mehrerer phosphorylierter, sulfatierter und sialylierter geladener N-Glykane, die aus dem mitochondrialen Proteinextrakt unter PNG-Behandlung freigesetzt wurden. Tabelle 2 zeigt alle Glykanzusammensetzungen, die in den gesamten Spektren identifiziert wurden, aber nicht in GlyConnect. Chi-Quadrat-Werte, die eine Passgenauigkeit testen, bestätigen den Nachweis von N-verknüpften Glykanen mit einem und zwei Chloraddukten und bestätigen den Nachweis dieser Glykanzusammensetzungen mit IR-MALDESI in Abbildung 5.

Abbildung 1: Gliederung des Protokolls. Schematische Darstellung der mitochondrialen Isolierung, Qualitätskontrolle, Proteinextraktion, N-Glykanfreisetzung und Schätzung mittels IR-MALDESI HRAM-Massenspektrometrie aus der BV2-Mikrogliazelllinie für den Hochdurchsatznachweis von mitochondrialen N-Glykanen. Abkürzung: IR-MALDESI HRAM = Infrared-Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization High-Resolution Accurate Mass Analyzer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Isolierung mitochondrialer Proteine aus BV2-Zellen. (A) Standardkurve für Mikro-BCA-Assays mit unterschiedlichen BSA-Konzentrationen. (B) Reproduzierbarkeit der Isolierung des mitochondrialen Proteins, dargestellt durch einen konsistenten Proteingehalt von 2 × 10⁷ Zellen in sechs unabhängigen mitochondrialen Präparaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Reinheit der mitochondrialen Zubereitung. Repräsentativer Western Blot für die zytoplasmatische Fraktion sowie isolierte Mitochondrien aus BV2-Mikrogliazellen. Die Abbildung zeigt das Immunblotting der zytoplasmatischen Fraktion und der isolierten Mitochondrien mit COX IV Antikörper (mitochondrialer Marker) und GAPDH Antikörper (zytoplasmatische Kontrolle). Das Fehlen von GAPDH-Banden in den isolierten Mitochondrien deutet auf eine minimale Kreuzkontamination und die Reinheit der mitochondrialen Vorbereitung für die nachfolgende N-Glykan-Analyse hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Bestimmung der Zusammensetzung der mitochondrialen N-Glykan-Identifizierung mittels IR-MALDESI HRAM-Massenspektrometrie. Glykanmassenspektren im Bereich von 1.700-2.000 m/z, die eine signifikante Anzahl von mehrfach geladenen Peaks mit den annotierten Strukturen zeigen, die mit Glycomod bestimmt wurden. Abkürzung: IR-MALDESI HRAM = Infrared-Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization High-Resolution Accurate Mass Analyzer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Verifizierung der nachgewiesenen mitochondrialen N-Glykane. Repräsentative Isotopenverteilungen für vier (A-D) mitochondriale N-verknüpfte Glykane, die eine Überlagerung der beobachteten Verteilung mit theoretischen Verteilungen von Chlor und deprotonierten Addukten zeigen. Chi-Quadrat-Werte auf den überlagerten Spektren repräsentieren die Passgenauigkeit und bestätigen den Nachweis von N-verknüpften Glykanen mit einem und zwei Chloraddukten. Dies ist eine weitere Bestätigung für den Nachweis dieser Glykanzusammensetzungen mittels IR-MALDESI. Abkürzung: IR-MALDESI = Infrarot-Matrix-unterstützte Laserdesorption Elektrospray-Ionisation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Im Protokoll verwendete Lösungs- und Pufferrezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Multiply geladene deprotonierte N-verknüpfte Glykane, die in den Mitochondrien mit hoher Massenmessgenauigkeit in Glycomod nachgewiesen wurden. Glykan-Kurzschreibweise: H = hexose; N = N-Acetylglucosamin; F = Fucose; S = N-Acetylneuraminsäure; Phos = Phosphat; Schwefel = Sulfat-Modifikation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Mikroglia sind die residenten Immunzellen des Gehirns, und Glykanmodifikationen modulieren den Immunphänotyp und die Funktion der Mikroglia. Diese Immunfunktionen erfordern erhebliche zelluläre Energie, die überwiegend von den Mitochondrien bereitgestellt wird. Bemerkenswert ist, dass die mitochondrialen Proteine auch Glykanmodifikationen aufweisen, die aufgrund der technologischen Herausforderungen bei der Untersuchung der subzellulären Glykosylierung bisher deutlich untererforscht sind. Die meisten Studien, die die mitochondriale Glykosylierung untersuchen, stützen sich auf die lektinbasierte Identifizierung von Glykanmustern²², obwohl diese Ansätze durch die schlechte Bindungsspezifität von Lektinen eingeschränkt sind. Die wesentlichen Fortschritte des in dieser Studie vorgestellten technischen Ansatzes sind i) die reproduzierbare Isolierung von mitochondrialen N-Glykanen aus Mikrogliazellen und ii) der Nachweis und die Identifizierung von mitochondrialen N-Glykanen mittels IR-MALDESI HRAM-Massenspektrometrie. Der hier beschriebene Arbeitsablauf ist der erste Bericht über den Nachweis von N-Glykanen, die von mitochondrialen Glykoproteinen freigesetzt werden, die in Mikrogliazellen auf physiologischen Ebenen exprimiert werden.

Im vorliegenden Protokoll wird die mitochondriale Isolierung durch die Verwendung der reagenzienbasierten Isolationsmethode maximiert. Dies kann mit der Dounce-Homogenisierungsmethode kombiniert werden, um die mitochondriale Ausbeute zu verbessern. Ein Nachteil der Verwendung des Homogenisators im Vergleich zur reagenzienbasierten Isolierung ist die Variation der Kraft und Geschwindigkeit des Stößels zwischen den Operatoren, was zu einer erhöhten experimentellen Variation und einer verringerten Reproduzierbarkeit führt. Frühere Studien^23,24 haben die Anwendung dieser Methode und das Fehlen von nukleären (Lamin, Histon H3) und ER-Markern (Calnexin, Erp57) in der mitochondrialen Fraktion gezeigt, was auf die Reinheit der mitochondrialen Fraktion hinweist. Eine mögliche Einschränkung des Protokolls ist die Anforderung von 20 Millionen Zellen als Ausgangsmaterial für die Mitochondrienisolierung. Die in unserer Studie beobachtete hohe mitochondriale Proteinkonzentration ermöglicht jedoch eine zehnfache Verkleinerung der anfänglichen Mikrogliazellzahl für die mitochondriale Isolierung auf der Grundlage der in früheren Studien^{durchgeführten Optimierung 25,26} (25-250 μg Proteine), ohne dass N-Glykan-Signale verloren gehen. Darüber hinaus könnte das Pooling biologischer Proben zur Gewinnung höherer Zellzahlen für die mitochondriale Isolierung bei eingeschränkter Skalierbarkeit des Protokolls durchgeführt werden, um die Zellzahlen aus Primärquellen wie Geweben für einen effizienten Glykannachweis zu senken. Darüber hinaus ist der Schritt der Glykanfreisetzung in diesem Protokoll von entscheidender Bedeutung. N-Glykosidae F (PNGase F) wird verwendet, um vollständige und intakte N-verknüpfte Glykane freizusetzen, indem die Amidbindung zwischen dem innersten N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und dem Asparaginrest^{hydrolysiert wird 27}. Für die N-Glykan-Analyse ist es entscheidend, die Aktivität von PNGase F zu optimieren, um eine vollständige De-Glykosylierung der mitochondrialen Proteine zu erreichen. Die Denaturierung von Proteinen unter Verwendung von Lösungsmitteln und überschüssigem Enzym trägt dazu bei, eine effiziente und vollständige Spaltung und Freisetzung der N-Glykane aus den mitochondrialen Proteinen zu gewährleisten. Eine Verdauungszeit von 18-20 h ist optimal für die Freisetzung von N-Glykanen durch Abschluss der PNGase F-Reaktion²⁶.

Eine mögliche Einschränkung dieses Protokolls ist die fehlende Anreicherung des Mitochondrienextrakts für Glykoproteine bei dieser Methode. Während die Glykoproteine mit geringer Abundanz in der Analyse möglicherweise nicht nachgewiesen werden, minimiert diese Methode den Fehler und die Verzerrung, die durch die Reinigung der Lektinaffinität oder die chemische Anreicherung entstehen. Während IR-MALDESI eine sehr zuverlässige Identifizierung der Zusammensetzung der identifizierten Glykane ermöglicht, erfordern genaue Informationen über die Verknüpfungen zwischen den Glykanresten weitere Untersuchungen mittels Tandem-Massenspektrometrie von lithiumadduktiven Glykanen, um die Kreuzringspaltung²⁸ oder den Exoglycosidase-Aufschluss zu verbessern. Alternativ kann LC-MS/MS zusätzlich oder als Alternative zum IR-MALDESI-Ansatz verwendet werden, der eine tiefere Glykanabdeckung mit mehr strukturellen Details bieten kann. Frühere Studien haben jedoch die Korrelation zwischen der durchschnittlichen Ionenhäufigkeit von IR-MALDESI für Metaboliten und den mit LC-MS/^{MS 29} bestimmten absoluten Mengen gezeigt, was eine Grundlage für die direkte Quantifizierung von Metaboliten mit IR-MALDESI bildet. Der hohe Durchsatz von IR-MALDESI mit der Fähigkeit, MS^2-Analysen durchzuführen, um eine hochzuverlässige strukturelle Bestätigung zu erhalten, ist für das schnelle Screening präklinischer und klinischer Proben auf potenzielle Glykan-Biomarker und die Diagnose von Krankheiten von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus ist zu beachten, dass, obwohl die Zentrifugation des postnukleären Überstands bei 3000 × g statt bei 12.000 × g die peroxisomalen und lysosomalen Kontaminanten minimiert, dennoch Spuren dieser Proteine in der mitochondrialen Zubereitung vorhanden sein können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine einfache Hochdurchsatzmethode mit minimaler Probenvorbereitung für die Analyse des mitochondrialen Glykoms in Mikrogliazellen und einem großen Anwendungspotenzial bei der Identifizierung neuartiger glykanbasierter therapeutischer Ziele für neurodegenerative Erkrankungen darstellt. Dieses Protokoll stellt eine umfassende Bewertung und Standardisierung der analytischen Methoden für die mitochondriale Isolierung aus Mikroglia und die anschließende Analyse des mitochondrialen Glykoms dar, um ein Scale-up für groß angelegte präklinische und klinische Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll bietet mehrere Vorteile für die Isolierung und den Nachweis von N-Glykanen: i) Die mitochondriale Isolationszeit für das reagenzienbasierte Protokoll ist gering (≤40 min); ii) die Ausbeute an Proteinen für die Glykanfreisetzung ist hoch; iii) dieselben mitochondrialen Proben, die für die N-Glykan-Analyse vorbereitet wurden, können für andere molekularbiologische Untersuchungen wie Proteomanalysen, Lektinanalysen und mitochondriale Flussanalysen verwendet werden; und iv) Die IR-MALDESI HRAM-Massenspektrometrie ermöglicht einen schnellen und verbesserten Nachweis von N-Glykanen aufgrund der Hybrid- und Weichionisationsstrategie²⁸ , ohne dass eine chemische Derivatisierung der geladenen Glykane wie Sialglykane und Sulfoglykane^{erforderlich ist 30}.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Amersham 600 imager	Cytvia	29194217	Gel and membrane imager
Countess 3 automated cell counter	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V	Thermofisher scientific	88870003
i-Blot2 Gel Transfer Device	Invitrogen	IB21001	Western blot transfer system
Inverted microscope	Cell Treat	04355223EA
Microplate reader		82050-760
Mini gel tank	Invitrogen	A25977
Open Air Rocker	Fisher Brand	88861025
Pipet boy	BioTek	229310
Vortex mixer	Integra- VWR
Mitochondria isolation reagents
Mitochondrial Isolation kit	Thermofisher scientific	89874
Phosphotase Inhibitor	Thermofisher scientific	1861274
Protease Inhibitor	Thermofisher scientific	1861281
N-glycan isolation and IR-MALDESI reagents
Acetic acid	Fisher Scientific	A11350	50% in ESI solvent
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM in ESI solvent
Ammonium bicarbonate	Fisher Scientific	A643500	100 mM
Calibration Solution	Thermofisher Scientific	A39239	Pierce FlexMix
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A322-10VL
LC/MS grade water	Thermofisher Scientific	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL, enzyme for N-glycan release
N-glycan isolation and IR-MALDESI consumables
Amicon centrifugal filters	Fisher Scientific	UFC501024	10 kDa MWCO
Mass spectrometer	Orbitrap Exploris 240
Mid-IR Laser	JGM Associates, Burlington, MA, USA
Teflon microwell slide	Prosolia, Indianapolis, IN, USA
N-glycan analysis softwares
GlycoMod	Expasy		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy		https://glyconnect.expasy.org/
Protein isolation and western blot consumables
Basix gel loading tips ( 10 µL)	Basix	13-611-102
Basix gel loading tips ( 200 µL)	Basix	13-611-116
Cell scrapper	VWR labs	14-388-100
i-Blot NC regular stacks	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF Regular Stacks	Invitrogen	IB24001
10  µL micropipette	Fisher Scientific	FBE00010
20 µL micropipette	Invitrogen	FBE00020
200  µL micropipette	Fisher Brand	FBE00200
1000 µL micropipette	Fisher brand	FBE01000
10  µL pipet tips	VWR labs	76322-528
20  µL pipet tips	VWR labs	76322-134
200  µL pipet tips	VWR labs	76322-150
1000  µL pipet tips	VWR labs	76322-154
Well plate	Fisher brand	14-388-100
Protein isolation and western blot reagents
Actin antibody ( Host : Rabbit )	Cell Signaling Technologies	8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked	Cell Signaling Technologies	7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
Bovine Serum Albumin	Fisher bioreagents	BP9700-100
COXIV antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	4844S
GAPDH antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	2118S
MicroBCA protein assay Kit	Thermofisher scientific	23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]	Thermofisher scientific	NP0001
PAGE Ruler prestained protein ladder	Thermofisher scientific	815-968-0747	Dilution= Use 7  µL to load onto first well
Phosphate buffered saline	Aniara Diagnostics	A12-9423-5	Prepare 1x PBS from 10x powder
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermofisher scientific	32106	Chemiluminescent substrate kit
RIPA Buffer	Thermofisher scientific	89901
Sample Buffer	Novex	B0007	The bolt LDS sample buffer is prepared in 3:1 ratio of sample to sample buffer
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
Tissue culture consumables
Countess Slides	Avantor	229411
Eppendorf tubes	Cell Treat	414004-265612-5884
2 mL aspirating pipet	Vista lab	5090-0010E
5 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11D
10 mL serological pipet	Basix	13-678-11E
25 mL serological pipet	Vista lab	FB012937
50 mL serological pipet	Vista lab	14955233
15 mL Conical tube	Avantor	229225A
50 mL conical tube	Cell treat	4190-0050
T-75 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012937
T-180 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012939
Tissue culture reagents
BV2 microglial cell line	Creative Bioarray	CSC-I2227Z	Immortalized Mouse Microglia (BV2) derived from C57/BL6 neonatal microglia
Cell dissociation enzymes	Thermofisher scientific	12563029	TrypLE
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Low Glucose Media	Gibco	10567014
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30071.03HI
Minimum Essential Medium (MEM) Non-essential Amino Acids	Gibco	11140050
Penicillium Streptomycin	Cytivia	SV30010
Phosphate buffer saline	Corning	21-040-CV
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282