Preparación mitocondrial de la microglía para el análisis de glicanos

Resumen

Se desarrolló un protocolo para la preparación de mitocondrias purificadas a partir de células microgliales, el aislamiento de proteínas mitocondriales para la liberación de N-glicanos y la detección rápida de glicanos mitocondriales subcelulares mediante ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja acoplada a espectrometría de masas de analizador de masas precisa de alta resolución.

Resumen

Comprender los patrones de glicosilación de las proteínas mitocondriales en la microglía es fundamental para determinar su papel en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, presentamos una metodología novedosa y de alto rendimiento para el análisis glicómico de proteínas mitocondriales aisladas de microglía cultivada. Este método implica el aislamiento de mitocondrias a partir de cultivos microgliales, la evaluación de la calidad de las muestras mitocondriales, seguida de una extracción optimizada de proteínas para maximizar la detección de glicanos, y la espectrometría de masas de alta resolución y precisión de masas (HRAM) de ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja (IR-MALDESI) para proporcionar perfiles detallados de la glicosilación mitocondrial.

Este protocolo enfatiza la importancia de mantener la integridad mitocondrial durante el aislamiento y emplea un estricto control de calidad para garantizar la reproducibilidad, incluida la medición de la pureza mitocondrial después de la extracción. Este enfoque permite el perfil completo de los cambios de glicosilación en las mitocondrias microgliales bajo diversas condiciones experimentales in vitro, lo que ofrece información sobre los cambios mitocondriales asociados con las enfermedades neurodegenerativas. Este enfoque podría adaptarse a otros tratamientos in vitro , otros tipos de células cultivadas o células primarias. A través de este enfoque estandarizado, nuestro objetivo es avanzar en la comprensión de los glicanos mitocondriales microgliales, contribuyendo al campo más amplio de la investigación neurodegenerativa.

Introducción

La microglía son las células inmunitarias innatas residentes dominantes en el cerebro y representan el 10-15% de las células en el cerebro adulto ^1,2. Utilizan su repertorio de receptores para monitorizar dinámicamente el microambiente cerebral y regular la función cerebral normal para mantener la homeostasis cerebral^. La microglía es muy sensible a los cambios en su microambiente y sufre cambios en la morfología celular, el inmunofenotipo y la función con condiciones patológicas o diversos estímulos. Los estados de activación microglial están influenciados por las demandas de energía celular requeridas para su función, como la fagocitosis, la producción de citocinas o la reparación de tejidos. Por lo tanto, el metabolismo energético celular juega un papel crucial en la regulación de los cambios en la función microglial⁴. La desregulación microglial conduce a una liberación excesiva de citocinas proinflamatorias (p. ej., IL-1β, TNF-α) y especies reactivas de oxígeno (ROS), predisponiendo al cerebro a la neuroinflamación ^5,6. La desregulación microglial crónica y el entorno neuroinflamatorio resultante sientan las bases para la neurodegeneración⁷.

El cerebro representa solo el 2% del peso corporal, pero el 20% del consumo total de energía del cuerpo. Las mitocondrias son la principal fuente de energía en las células cerebrales y actúan como actores clave en la patogénesis de los trastornos cerebrales agudos y^crónicos. Estudios previos han establecido una fuerte correlación entre la activación microglial y la disfunción metabólica en la edad^{de 9} años y los trastornos relacionados con la edad, como la enfermedad de Alzheimer^10,11, destacando el papel fundamental de las mitocondrias en la senescencia celular y la neurodegeneración. El deterioro de la función mitocondrial conduce a una disminución de la producción de energía, un aumento del estrés oxidativo y un aumento de la neuroinflamación durante el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad.

Si bien una amplia investigación ha dilucidado el papel de las mitocondrias en el metabolismo energético, el envejecimiento y los trastornos cerebrales, el papel de las modificaciones postraduccionales comunes, como la glicosilación, en la biología y la función mitocondrial sigue sin explorarse lo suficiente. La glicosilación, la adición enzimática de trozos de azúcar llamados glicanos a las proteínas por las enzimas de glicosilación, es la modificación postraduccional más común en la mayoría de las células cerebrales, incluida la microglía. Las microglías activadas modulan su función inmune bajo estímulos inflamatorios mediante la regulación de la expresión de glicanos intracelular o de la superficie celular¹². Las respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias exhibidas por la microglía después de la estimulación también están reguladas por los glicanos¹³. Las proteínas mitocondriales también tienen estas modificaciones de glicanos, que regulan su función y localización. Sin embargo, se carece de un análisis detallado de los patrones de glicosilación mitocondrial específicos de la célula en la microglía debido a los desafíos técnicos en la investigación de la glicosilación subcelular. A pesar de las funciones bien caracterizadas de la glicosilación en la modulación del fenotipo microglial, el papel de los glicanos en la modulación de la función mitocondrial y, posteriormente, el inmunofenotipo celular en la microglía sigue siendo poco conocido.

Los estudios limitados que investigan la glicosilación de proteínas mitocondriales se han centrado principalmente en la identificación de patrones de glicosilación basada en lectinas. Las lectinas son proteínas de unión a glicanos que se unen a fracciones biomoleculares de glicanos^14,15, que carecen de la especificidad y la capacidad de proporcionar información detallada sobre la composición de glicanos. Las modalidades de espectrometría de masas ofrecen una identificación detallada de las composiciones de glicanos para superar los desafíos analíticos presentados por el análisis de lectinas. Una de estas modalidades, la ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja (IR-MALDESI), emplea una estrategia de ionización híbrida, utilizando un láser de infrarrojo medio para excitar resonantemente el agua que se encuentra en los especímenes biológicos¹⁶ para dessorber las especies neutras y someterlas a una pluma de electrospray ortogonal, seguida de un análisis utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap de alta resolución y precisión. IR-MALDESI se ha demostrado previamente para el análisis directo de metabolitos tisulares¹⁷, con claras ventajas de análisis rápido¹⁸, método de ionización suave y la predictibilidad del contenido de ácido siálico de los glicanos N-ligados en función de los patrones de distribución isotópica de los aductos de glicanos clorados¹⁹. Sin embargo, no se ha demostrado la adaptación de esta plataforma para el análisis directo de glicanos subcelulares.

Aquí, informamos sobre un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento mitocondrial de células microgliales, el aislamiento de N-glicanos mitocondriales y la detección y análisis de N-glicanos mitocondriales mediante espectrometría de masas IR-MALDESI. Este protocolo será fundamental para descubrir nuevos conocimientos sobre el papel de la glicosilación en la función mitocondrial, lo que podría identificar nuevos objetivos terapéuticos para los trastornos neuroinflamatorios y neurodegenerativos.

Protocolo

1. Cultivo de líneas celulares microgliales BV2

1. Mantener las células BV-2 (células microgliales derivadas de ratones C57BL/6) en medios DMEM bajos en glucosa suplementados con un 10% de suero fetal bovino (FBS), un 1% de penicillium-estreptomicina (PenStrep) y un 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA).
2. Cultive las células en matraces T-175 y permita que alcancen un 70-80% de confluencia.
3. Dividir las células incubando con las enzimas de disociación celular durante 5 min a 37 °C en CO₂ al 5%, seguido de la inactivación de las enzimas con un volumen igual de medio celular y centrifugación de las células durante 5 min a 500 × g a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Las enzimas de disociación celular utilizadas aquí son más suaves con las células BV2 que la tripsina y se pueden usar para proteger la expresión del antígeno de la superficie celular.
4. Aspire el medio, vuelva a suspender el pellet de células en 1 ml de medio de crecimiento y cuente las células con azul de tripán (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Utilizamos un contador de celdas automatizado para este paso para contar las células.
5. Para llevar a cabo el aislamiento mitocondrial, proceda si el pellet de celda contiene 2 × 10⁷ (20 millones de células/pellet).

2. Aislamiento de mitocondrias a partir de células microgliales

NOTA: Trabaje rápidamente, manteniendo todo en hielo durante todo el procedimiento. El kit de aislamiento mitocondrial utilizado para el aislamiento mitocondrial tiene tres componentes: reactivos A (tampón de lisis celular), reactivo B (tampón estabilizador) y reactivo C (tampón de lavado mitocondrial). Añada inhibidores de la proteasa al reactivo A y al reactivo C inmediatamente antes de su uso.

1. Pellet 2 × 10⁷ celdas centrifugando las celdas recolectadas en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL a 500 × g durante 5 min. Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante.
2. Añadir 800 μL de reactivo de aislamiento mitocondrial A (tampón de lisis celular), vórtice a velocidad media durante 5 s e incubar el tubo en hielo durante exactamente 2 min.
   NOTA: No exceda los 2 minutos de incubación.
3. Añadir 10 μL de reactivo de aislamiento mitocondrial B (tampón estabilizador), vórtice a máxima velocidad durante 5 s e incubar el tubo en hielo durante 5 min, vórtice a máxima velocidad cada minuto.
4. Añadir 800 μL de reactivo de aislamiento de mitocondrias C (tampón de lavado mitocondrial), invertir el tubo varias veces para mezclar y centrifugar el tubo a 700 × g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: No haga vórtice.
5. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2,0 mL y centrifugue a 3.000 × g durante 15 min a 4 °C.
6. Transfiera el sobrenadante (porciones citosólicas) a un tubo nuevo. El pellet contiene las mitocondrias aisladas.
7. Añada 500 μL de reactivo de aislamiento de mitocondrias C al pellet y centrifugue a 12.000 × g durante 5 min.
8. Utilice el pellet para la cuantificación y el procesamiento de proteínas o almacene el pellet a -80 °C hasta su uso posterior.

3. Estimación de proteínas mediante ensayo de microBCA

NOTA: La estimación de proteínas para este protocolo se puede realizar utilizando diferentes reactivos y ensayos. La cuantificación de proteínas citosólicas o mitocondriales se puede realizar mediante la normalización frente a la concentración total de proteínas utilizada en el ensayo.

1. Prepare patrones de albúmina sérica bovina (BSA) entre 0 μg/mL y 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) y blancos con tampón de lisis solamente.
2. Agregue 150 μL de cada patrón en la placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene las muestras.
3. Mezcle 25 partes de Micro BCA Reactivo MA (solución de ácido bicincónico (BCA)) y 24 partes de Reactivo MB (solución de sulfato de cobre) con 1 parte de Reactivo MC (tampón estabilizador) (25:24:1, Reactivos MA:MB:MC) para crear un reactivo de trabajo. Añadir 150 μL del reactivo BCA mezclado a cada muestra y patrón.
4. Incubar a 37 °C durante 2 h.
5. Utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 562 nm y cuantificar la concentración de proteínas con la curva estándar. Reste la absorbancia del patrón en blanco de la medición de la absorbancia de todos los demás patrones individuales y réplicas de muestras desconocidas para obtener las concentraciones de proteínas de la muestra.

4. Control de calidad de la preparación mitocondrial (Western blot)

1. Vuelva a suspender el gránulo mitocondrial en el tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) para realizar la cuantificación de proteínas. Determine la concentración de proteínas para cada muestra utilizando el ensayo de micro BCA.
2. Desnaturalizar las muestras en un tampón de muestras a 94 ^oC durante 5 min.
3. Cargue cantidades iguales (20 μg) de proteína mitocondrial en geles prefabricados (consulte la tabla de materiales), junto con el marcador de peso molecular.
4. Deje correr el gel durante 50 minutos a 100 V.
   NOTA: El tiempo de funcionamiento puede variar, así que asegúrese de detener el gel cuando las proteínas hayan alcanzado el final del gel indicado por el tinte en el tampón de muestra.
5. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando el protocolo de transferencia en seco en un sistema de transferencia de Western blot durante 7 min a 20 V.
6. Retirar la membrana y bloquear con la solución de bloqueo (Tabla 1) durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Añadir diluciones apropiadas del anticuerpo primario a la membrana en tampón bloqueante durante la noche a 4 ^oC (COXIV= 1:3.000, GAPDH =1:3.000).
   NOTA: La ausencia de contaminación nuclear del retículo endoplásmico (RE) en la preparación mitocondrial se puede probar mediante el uso de marcadores adicionales como lamin (marcador nuclear) y ERp57 (marcador ER) en Western blots.
8. Lave la membrana durante 3 x 15 min con el tampón de lavado (Tabla 1).
9. Incubar la membrana con la dilución adecuada de anticuerpo secundario conjugado con HRP en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h
10. Lave la membrana durante 3 x 15 min con el tampón de lavado.
11. Para el revelado, utilice un kit de sustrato quimioluminiscente.
12. Escanee la membrana con un generador de imágenes de gel y membrana.

5. Aislamiento de proteínas mitocondriales para la extracción de N-glicanos de la microglía

1. Vuelva a suspender las mitocondrias aisladas en 50 μL de tampón de aislamiento de proteínas (Tabla 1) y deje actuar en hielo durante 20 min.
2. Aspirar y dispensar tres veces y dejar 20 min en hielo (vórtice antes de usar). Si el gránulo mitocondrial no está completamente solubilizado, agregue otros 50 μL del tampón de aislamiento y acumule en el mismo tubo.
3. Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min.
4. Recuperar el sobrenadante, congelar a -80 ^oC durante un mínimo de 1 h y secar lo máximo posible en un concentrador de vacío.
5. Vuelva a suspender antes del aislamiento de glicanos utilizando el tampón de digestión PNGase (Tabla 1) para IR-MALDESI.

6. Preparación mitocondrial de N-glicanos para IR-MALDESI

1. Cargue 25-250 μg de proteína (en un volumen máximo de 250 μL) de proteínas mitocondriales aisladas en un filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa.
2. Reduzca las muestras de proteínas para exponer los restos de glicanos agregando 2 μL de 1 M de ditiotreitol (DTT) a cada muestra en el filtro.
3. Diluya la muestra con 200 μL de tampón de digestión PNGase y vórtice ligeramente para evitar alterar el filtro.
4. Desnaturalizar las proteínas mitocondriales incubando la muestra a 56 °C durante 30 min.
5. Utilice 50 μL de yodoacetamida 1 M para alquilar las mitocondrias y obtener una concentración final de ~200 mM, e incubar a 37 °C durante 60 min.
6. Para concentrar aún más los métodos mitocondriales desnaturalizados, centrifugar las muestras a 14.000 × g durante 40 minutos. Deseche el flujo.
7. Lave la muestra con 100 μL de tampón de digestión PNGase.
8. Concentre la glicoproteína en el filtro a 14.000 × g durante 20 minutos y deseche el flujo. Repita el paso de lavado y concentrado 2 veces, para un total de 3 veces, produciendo un concentrado en el volumen muerto del filtro (~5 μL). Descarte todo el flujo.
9. Deseche el frasco de recolección una vez que se hayan completado los lavados. Utilice un nuevo vial de recolección para todos los eluyentes y lavados futuros.
10. Para escindir los glicanos de los glicopatrones mitocondriales desnaturalizados, transfiéralos a un vial de recolección fresco y agregue 2 μL de PNGasa sin glicerol (75,000 unidades/mL) al filtro. Agregue 98 μL de tampón de digestión PNGasa, llevando el volumen total a 100 μL y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en el filtro.
11. Incubar muestras a 37 °C durante 18 h para escindir enzimáticamente todos los N-glicanos de las proteínas mitocondriales.
12. Eluir los N-glicanos mitocondriales liberados centrifugando la muestra a 14.000 × g durante 20 min a 20 °C.
13. Lave los glicanos mitocondriales añadiendo 100 μL de tampón de digestión PNGase al filtro y centrifugue a 14.000 × g durante 20 min a 20 °C. Recoja el lavado que contenga los N-glicanos restantes en el mismo vial de recolección que el eluyente. Repita 2 veces y retire el filtro del vial de recolección.
14. Incubar las muestras de glicanos mitocondriales en el congelador a -80 °C hasta su congelación (30-60 min) y secar hasta su finalización a temperatura ambiente en un concentrador de vacío (4-6 h para 400 μL).
    NOTA: Los N-glicanos pueden almacenarse a -20 °C hasta 6 meses antes del análisis.
15. Vuelva a suspender los glicanos N-ligados secos en 50 μL de agua de grado LC/MS directamente antes del análisis IR-MALDESI.

7. Detección de glicanos liberados por espectrometría de masas IR-MALDESI

1. Realice la calibración de masa cada día del experimento. Cargue la solución de calibración en una bomba de jeringa y empuje a una velocidad de 1,2 μL/min. Aplique un voltaje de 3,5 kV para lograr una pluma de electrospray estable para la calibración de masas tanto en modo positivo como negativo.
2. Pipetear 5 μL de glicanos mitocondriales resuspendidos en un punto de muestra en un portaobjetos de micropocillos de teflón.
3. Utilice un láser de infrarrojo medio que funcione a una longitud de onda de 2,97 μm para la ablación con una energía de 1,8 mJ por ráfaga.
4. Ionizar y detectar N-glicanos en modo de ionización negativa. Utilice un disolvente de electrospray compuesto por un 60% de acetonitrilo y 1 mM de ácido acético para crear una columna de electrospray estable con un caudal de 2 μL/min a una tensión de 3,2 kV.
5. Para realizar el análisis, acople IR-MALDESI a un espectrómetro de masas HRAM configurado a una potencia de resolución de masa de 240.000_FWHM a m/z 200, analizando entre 500 y 2.000 m/z en modo de ionización negativa.
6. Apague el control automático de ganancia (AGC) y establezca un tiempo de inyección fijo de 90 ms. Utilice la fuente EasyIC para la calibración interna en tiempo real de cada espectro para lograr una alta precisión de medición de masa (MMA).

8. Análisis de datos de N-glicanos mitocondriales

1. Identifique manualmente los glicanos ligados a N mediante la búsqueda de masas monoisotópicas y la confirmación de distribuciones isotópicas utilizando el espaciado m/z para determinar iones cargados doble y triplemente que tienen un umbral mínimo de flujo iónico de 1.000 iones/s.
2. Convierta los espectros de masas brutos de relaciones m/z a masas monoisotópicas neutras.
3. Cargue las masas monoisotópicas en una herramienta de predicción de la estructura de los oligosacáridos en línea para determinar las posibles composiciones de glicanos. Confirme las anotaciones utilizando una base de datos glicómica seleccionada experimentalmente²⁰; asegúrese de que cada identificación esté dentro del margen de 2,5 ppm MMA, contenga la estructura central de glicanos ligados a N (hexadecimal₃, hexNAc₂) y excluya las pentosas, KDN o monosacáridos hexA.
4. Dibuje las estructuras de glicanos confirmadas utilizando la nomenclatura SNFG²¹.
5. Obtener la abundancia relativa de glicanos a partir de los espectros de masas brutos y normalizar frente a la cantidad de proteína mitocondrial en μg para obtener iones/s/μg.
6. Utilice el análisis de Chi-cuadrado para probar la bondad del ajuste entre las distribuciones teórica y experimental de los glicanos ligados a N para determinar el número de aductos de cloro. Esto permite determinar directamente el número de ácidos siálicos¹⁹.

Resultados

La Figura 1 representa un esquema esquemático de los pasos involucrados en el aislamiento de mitocondrias de la línea celular microglial BV2 para el análisis de glicanos por espectrometría de masas. La reproducibilidad del aislamiento de proteínas mitocondriales entre diferentes preparaciones mitocondriales a partir de la misma densidad inicial de las células microgliales se representa en la Figura 2, que no muestra diferencias significativas entre la concentración de proteínas mitocondriales estimada mediante el ensayo de micro BCA.

La Figura 3 representa la pureza de los aislamientos mitocondriales utilizando el análisis de Western blot de COX IV y GAPDH. Aquí, vemos la expresión de la proteína mitocondrial COX IV en la fracción mitocondrial aislada en el paso final del aislamiento basado en reactivos utilizado en el protocolo. Los inmunoblots muestran una banda COX IV prominente en la fracción mitocondrial aislada, mientras que GAPDH solo se detecta en la fracción citoplasmática con la misma exposición. Los tiempos de exposición más largos pueden resultar en la detección de una banda GAPDH tenue. La expresión del marcador no mitocondrial GAPDH es evidente en el lisado de toda la célula después del aislamiento de las mitocondrias, sin las bandas CoxIV, lo que indica un aislamiento completo de la fracción mitocondrial y una contaminación no mitocondrial mínima. La expresión de COX IV en las fracciones mitocondriales es consistente entre diferentes preparaciones con una densidad celular inicial similar de 2 × 10⁷ células.

Los espectros de masas representativos de los N-glicanos liberados detectados mediante IR-MALDESI en la Figura 4 muestran la presencia de varios N-glicanos cargados fosforilados, sulfatados y sialilados liberados del extracto de proteína mitocondrial mediante el tratamiento con PNGasa. La Tabla 2 reporta todas las composiciones de glicanos que se identificaron en los espectros completos pero que no se informaron en GlyConnect. Los valores de Chi-cuadrado que prueban una bondad de ajuste confirman la detección de glicanos ligados a N con uno y dos aductos de cloro, lo que confirma la detección de estas composiciones de glicanos utilizando IR-MALDESI en la Figura 5.

Figura 1: Esquema del protocolo. Esquema esquemático del aislamiento mitocondrial, control de calidad, extracción de proteínas, liberación de N-glicanos y estimación mediante espectrometría de masas IR-MALDESI HRAM de la línea celular microglial BV2 para la detección de alto rendimiento de N-glicanos mitocondriales. Abreviatura: IR-MALDESI HRAM = Analizador de masas preciso de alta resolución de ionización de desorción láser asistido por matriz infrarroja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Aislamiento de proteínas mitocondriales de células BV2. (A) Curva estándar para el ensayo de micro BCA utilizando diferentes concentraciones de BSA. (B) Reproducibilidad del aislamiento de proteínas mitocondriales representado por el contenido constante de proteínas de 2 × 10⁷ células en seis preparaciones mitocondriales independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Pureza de la preparación mitocondrial. Western blot representativo de la fracción citoplasmática, así como de las mitocondrias aisladas de las células microgliales BV2. La figura representa la inmunotransferencia de la fracción citoplasmática y las mitocondrias aisladas con anticuerpo COX IV (marcador mitocondrial) y anticuerpo GAPDH (control citoplasmático). La ausencia de bandas de GAPDH en las mitocondrias aisladas indica una contaminación cruzada mínima y la pureza de la preparación mitocondrial para el análisis posterior de N-glicanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Determinación de la composición de la identificación de N-glicanos mitocondriales mediante espectrometría de masas IR-MALDESI HRAM. Espectros de masas de glicanos en el rango de 1.700-2.000 m/z que muestran un número significativo de picos cargados múltiples con las estructuras anotadas determinadas mediante Glycomod. Abreviatura: IR-MALDESI HRAM = Analizador de masas preciso de alta resolución de ionización de desorción láser asistido por matriz infrarroja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Verificación de los N-glicanos mitocondriales detectados. Distribuciones isotópicas representativas para cuatro glicanos mitocondriales ligados a N (A-D) que muestran una superposición de la distribución observada con distribuciones teóricas de cloro y aductos desprotonadas. Los valores de Chi-cuadrado en los espectros superpuestos representan la bondad de ajuste y confirman la detección de glicanos ligados a N con uno y dos aductos de cloro. Esta es una confirmación más de la detección de estas composiciones de glicanos mediante IR-MALDESI. Abreviatura: IR-MALDESI = Ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recetas de solución y tampón utilizadas en el protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: GlicanosN-ligados desprotonados completamente cargados detectados en las mitocondrias con alta precisión de medición de masa en Glycomod. Notación abreviada de glicanos: H = hexosa; N = N-acetilglucosamina; F = fucosa; S = ácido N-acetilneuramínico; Phos = fosfato; Sulfio = modificación de sulfato. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La microglía son las células inmunitarias residentes del cerebro, y las modificaciones de los glicanos modulan el inmunofenotipo y la función de la microglía. Estas funciones inmunitarias exigen una cantidad sustancial de energía celular, que es suministrada predominantemente por las mitocondrias. En particular, las proteínas mitocondriales también presentan modificaciones de glicanos, que han permanecido significativamente poco estudiadas debido a los desafíos tecnológicos en la investigación de la glicosilación subcelular. La mayoría de los estudios que investigan la glicosilación mitocondrial se basan en la identificación de los patrones de glicanos basada en lectinas²², aunque estos enfoques están limitados por la escasa especificidad de unión de las lectinas. Los avances esenciales del enfoque técnico presentado en este estudio son: i) el aislamiento reproducible de N-glicanos mitocondriales a partir de células microgliales y ii) la detección e identificación de N-glicanos mitocondriales mediante espectrometría de masas IR-MALDESI HRAM. El flujo de trabajo descrito aquí es el primer informe de la detección de N-glicanos liberados de glicoproteínas mitocondriales expresados a niveles fisiológicos en células microgliales.

En el presente protocolo, el aislamiento mitocondrial se maximiza mediante el uso del método de aislamiento basado en reactivos. Esto se puede combinar con el método de homogeneización Dounce para mejorar el rendimiento mitocondrial. Un inconveniente del uso del homogeneizador en comparación con el aislamiento basado en reactivos es la variación en la fuerza y la velocidad del mortero entre los operadores, lo que resulta en una mayor variación experimental y una menor reproducibilidad. Estudios previos ^23,24 han indicado el uso de este método y la ausencia de marcadores nucleares (lamina, histona H3) y RE (calnexina, Erp57) en la fracción mitocondrial, lo que indica la pureza de la fracción mitocondrial. Una limitación potencial del protocolo es el requerimiento de 20 millones de células como material de partida para el aislamiento de mitocondrias. Sin embargo, la alta concentración de proteínas mitocondriales observada en nuestro estudio permite reducir diez veces el número inicial de células microgliales para el aislamiento mitocondrial en base a la optimización realizada en estudios previos ^25,26 (25-250 μg de proteínas) sin perder ninguna señal de N-glicanos. Además, la agrupación de muestras biológicas para obtener un mayor número de células para el aislamiento mitocondrial podría realizarse en caso de una escalabilidad limitada del protocolo para reducir el número de células de fuentes primarias como los tejidos para una detección eficiente de glicanos. Además, el paso de liberación de glicanos es fundamental en este protocolo. La N-glicosidasa F (PNGasa F) se utiliza para liberar glicanos ligados a N completos e intactos mediante la hidrolización del enlace amida entre la N-acetilglucosamina más interna (GlcNAc) y el residuo de asparagina²⁷. Para el análisis de N-glicanos, es fundamental optimizar la actividad de la PNGasa F para lograr la desglicosilación completa de las proteínas mitocondriales. La desnaturalización de las proteínas mediante la exposición a disolventes y el exceso de enzimas ayuda a garantizar una escisión y liberación eficientes y completas de los N-glicanos de las proteínas mitocondriales. Un tiempo de digestión de 18-20 h es óptimo para la liberación de N-glicanos al completar la reacción PNGasa^{F 26}.

Una limitación potencial de este protocolo es la falta de enriquecimiento del extracto mitocondrial para glicoproteínas en este método. Si bien es posible que las glicoproteínas de baja abundancia no se detecten en el análisis, este método minimiza el error y el sesgo introducidos por la purificación de afinidad de lectina o el enriquecimiento químico. Si bien IR-MALDESI proporciona una identificación de alta confianza de la composición de los glicanos identificados, la información precisa sobre los enlaces entre los residuos de glicanos requiere una investigación más profunda utilizando espectrometría de masas en tándem de glicanos aducidos por litio para mejorar las divisiones de anillos cruzados²⁸ o las digestiones de exoglucosidasas. Alternativamente, LC-MS/MS se puede utilizar además o como alternativa al enfoque IR-MALDESI, que puede proporcionar una cobertura de glicanos más profunda con más detalles estructurales. Sin embargo, estudios previos han demostrado la correlación entre la abundancia media de iones de IR-MALDESI para los metabolitos con las cantidades absolutas determinadas por LC-MS/MS²⁹, estableciendo una base para la cuantificación directa de metabolitos utilizando IR-MALDESI. La naturaleza de alto rendimiento de IR-MALDESI, con la capacidad de realizar análisis MS² para proporcionar una confirmación estructural de alta confianza, es fundamental para el cribado rápido de muestras preclínicas y clínicas en busca de posibles biomarcadores de glicanos y el diagnóstico de enfermedades. Además, hay que tener en cuenta que, aunque la centrifugación del sobrenadante postnuclear a 3000 × g en lugar de a 12.000 × g minimiza los contaminantes peroxisomales y lisosomales, todavía puede haber trazas de estas proteínas presentes en la preparación mitocondrial.

En conclusión, este estudio presenta un método simple y de alto rendimiento, con una preparación mínima de la muestra para el análisis del glicoma mitocondrial en células microgliales y un gran potencial de aplicación en la identificación de nuevas dianas terapéuticas basadas en glicanos para enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo presenta una evaluación integral y la estandarización de los métodos analíticos para el aislamiento mitocondrial de la microglía y el análisis posterior del glicoma mitocondrial para permitir la ampliación de estudios preclínicos y clínicos a gran escala. Este protocolo presenta varias ventajas para el aislamiento y la detección de N-glicanos: i) el tiempo de aislamiento mitocondrial para el protocolo basado en reactivos es bajo (≤40 min); ii) el rendimiento de proteínas para la liberación de glicanos es alto; iii) las mismas muestras mitocondriales preparadas para el análisis de N-glicanos pueden utilizarse para otras investigaciones biológicas moleculares, como el análisis proteómico, el análisis de lectinas y el análisis de flujo mitocondrial; y iv) la espectrometría de masas IR-MALDESI HRAM permite una detección rápida y mejorada de N-glicanos debido a la estrategia de ionización híbrida y suave²⁸ sin la necesidad de derivatización química de los glicanos cargados como sialoglicanos y sulfoglicanos³⁰.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Amersham 600 imager	Cytvia	29194217	Gel and membrane imager
Countess 3 automated cell counter	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V	Thermofisher scientific	88870003
i-Blot2 Gel Transfer Device	Invitrogen	IB21001	Western blot transfer system
Inverted microscope	Cell Treat	04355223EA
Microplate reader		82050-760
Mini gel tank	Invitrogen	A25977
Open Air Rocker	Fisher Brand	88861025
Pipet boy	BioTek	229310
Vortex mixer	Integra- VWR
Mitochondria isolation reagents
Mitochondrial Isolation kit	Thermofisher scientific	89874
Phosphotase Inhibitor	Thermofisher scientific	1861274
Protease Inhibitor	Thermofisher scientific	1861281
N-glycan isolation and IR-MALDESI reagents
Acetic acid	Fisher Scientific	A11350	50% in ESI solvent
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM in ESI solvent
Ammonium bicarbonate	Fisher Scientific	A643500	100 mM
Calibration Solution	Thermofisher Scientific	A39239	Pierce FlexMix
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A322-10VL
LC/MS grade water	Thermofisher Scientific	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL, enzyme for N-glycan release
N-glycan isolation and IR-MALDESI consumables
Amicon centrifugal filters	Fisher Scientific	UFC501024	10 kDa MWCO
Mass spectrometer	Orbitrap Exploris 240
Mid-IR Laser	JGM Associates, Burlington, MA, USA
Teflon microwell slide	Prosolia, Indianapolis, IN, USA
N-glycan analysis softwares
GlycoMod	Expasy		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy		https://glyconnect.expasy.org/
Protein isolation and western blot consumables
Basix gel loading tips ( 10 µL)	Basix	13-611-102
Basix gel loading tips ( 200 µL)	Basix	13-611-116
Cell scrapper	VWR labs	14-388-100
i-Blot NC regular stacks	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF Regular Stacks	Invitrogen	IB24001
10  µL micropipette	Fisher Scientific	FBE00010
20 µL micropipette	Invitrogen	FBE00020
200  µL micropipette	Fisher Brand	FBE00200
1000 µL micropipette	Fisher brand	FBE01000
10  µL pipet tips	VWR labs	76322-528
20  µL pipet tips	VWR labs	76322-134
200  µL pipet tips	VWR labs	76322-150
1000  µL pipet tips	VWR labs	76322-154
Well plate	Fisher brand	14-388-100
Protein isolation and western blot reagents
Actin antibody ( Host : Rabbit )	Cell Signaling Technologies	8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked	Cell Signaling Technologies	7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
Bovine Serum Albumin	Fisher bioreagents	BP9700-100
COXIV antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	4844S
GAPDH antibody ( Host : Rabbit)	Cell Signaling Technologies	2118S
MicroBCA protein assay Kit	Thermofisher scientific	23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]	Thermofisher scientific	NP0001
PAGE Ruler prestained protein ladder	Thermofisher scientific	815-968-0747	Dilution= Use 7  µL to load onto first well
Phosphate buffered saline	Aniara Diagnostics	A12-9423-5	Prepare 1x PBS from 10x powder
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermofisher scientific	32106	Chemiluminescent substrate kit
RIPA Buffer	Thermofisher scientific	89901
Sample Buffer	Novex	B0007	The bolt LDS sample buffer is prepared in 3:1 ratio of sample to sample buffer
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
Tissue culture consumables
Countess Slides	Avantor	229411
Eppendorf tubes	Cell Treat	414004-265612-5884
2 mL aspirating pipet	Vista lab	5090-0010E
5 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11D
10 mL serological pipet	Basix	13-678-11E
25 mL serological pipet	Vista lab	FB012937
50 mL serological pipet	Vista lab	14955233
15 mL Conical tube	Avantor	229225A
50 mL conical tube	Cell treat	4190-0050
T-75 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012937
T-180 cm2 Tissue culture flask	Fisher Scientific	FB012939
Tissue culture reagents
BV2 microglial cell line	Creative Bioarray	CSC-I2227Z	Immortalized Mouse Microglia (BV2) derived from C57/BL6 neonatal microglia
Cell dissociation enzymes	Thermofisher scientific	12563029	TrypLE
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Low Glucose Media	Gibco	10567014
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30071.03HI
Minimum Essential Medium (MEM) Non-essential Amino Acids	Gibco	11140050
Penicillium Streptomycin	Cytivia	SV30010
Phosphate buffer saline	Corning	21-040-CV
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282