T2DM 小鼠腹部按摩的固定及作方法

摘要

本研究介绍了一种小鼠腹部按摩装置，该设备复制了手动按摩，同时最大限度地减少了压力和组织损伤。该设备可显着降低 2 型糖尿病小鼠的血糖水平、改善脂质代谢并提高胰岛素敏感性，提供了一种具有临床潜力的有前途的非侵入性治疗方法。

摘要

2 型糖尿病 （T2DM） 是一个快速增长的全球公共卫生问题，影响着全球超过 5 亿人。尽管腹部按摩在治疗 T2DM 方面显示出潜在益处，但其有效性仍不清楚，尤其是在动物研究中，动物依从性和精确压力控制需求等挑战使实施复杂化。为了应对这些挑战，本研究引入了一种专为小鼠设计的新型腹部按摩模拟设备。该设备提供了一种实用的解决方案，可以以受控的方式进行腹部按摩干预，同时最大限度地减少对动物的压力和组织损伤。它安全地束缚老鼠的四肢，让它们在按摩过程中保持清醒，并精确控制按摩到腹部的压力和频率。该设备能够准确模拟手动腹部按摩，为评估其对 T2DM 影响的实验研究提供了新的可能性。该方案的主要目标是研究腹部按摩对小鼠关键 T2DM 标志物的影响，例如血糖水平、脂质代谢和胰岛素敏感性。通过提供可靠且可重复的腹部按摩方法，该设备可以为其作为 T2DM 非侵入性治疗干预的潜力提供有价值的见解。这项研究的结果可能有助于推进糖尿病预防和治疗的临床策略，特别是加强现代医学实践中对腹部按摩等传统疗法的理解。

引言

2 型糖尿病 （T2DM） 是一种以胰岛素抵抗和胰腺 β 细胞功能障碍为特征的慢性疾病。这是一个全国性的公共卫生问题，全球发病率迅速上升¹。根据《全球代谢疾病负担报告》，全球有超过 5 亿人患有糖尿病，其中超过 90% 的人患有² 型糖尿病。腹部按摩是治疗 T2DM 的重要干预措施。大量研究表明，腹部按摩可以显着改善 T2DM 患者的血糖水平、生活质量、肠道微生物群组成及其代谢产物，从而提高胰岛素敏感性 ^3,4,5。此外，腹部按摩可促进胃肠道蠕动，改善消化功能，减少胃肠道瘀滞，并优化营养吸收和葡萄糖代谢 ^6,7,8。尽管腹部按摩具有改善 T2DM 结果的潜力，但尚未得到充分探索。具体来说，腹部按摩已被证明可以通过调节胰岛素信号通路等代谢途径来改善胰岛素敏感性和葡萄糖代谢，但确切的生理过程尚不完全清楚。本研究旨在通过提供更详细的机制见解来弥合这一差距，了解腹部按摩如何改善动物模型中的 T2DM。

本研究的主要目标是设计和开发一种标准化、可重复的方法，以使用专为小鼠设计的创新设备研究腹部按摩对 T2DM 的影响。该设备旨在提供对按摩参数（如压力和频率）的精确控制，同时最大限度地减少动物压力并确保动物福利合规性。

然而，对动物模型，尤其是小鼠进行腹部按摩，存在一些挑战。当前的研究方法面临挑战，包括不一致的按摩应用、难以保持一致的压力和频率以及在干预期间确保动物依从性。这些限制阻碍了可重复性并引入了结果的可变性，强调了对更有效和可靠的技术的需求。动物实验对于回答这个问题至关重要。对于动物的腹部按摩，必须保持一定的压力和频率。然而，在实践中，让动物遵守指示并保持在设备内所需的位置并不容易，因为它们是自然活跃的。在干预过程中确保一致的压力和速度也具有挑战性，这使得难以达到腹部按摩技术所需的稳定性。因此，对小鼠、大鼠和其他动物模型进行腹部按摩干预仍然是研究中的重大挑战。此外，动物实验必须解决与动物福利相关的问题，例如缓解压力和焦虑、减轻疼痛和改善整体状况。现有的方法，如麻醉后按摩或手动约束，通常是劳动密集型的，引入了实验偏差，或者无法在有意识的动物中复制自然生理条件。以前的解决方案涉及大鼠腹部按摩模型^9、10、11。为了克服这些限制，我们推出了一种新型的小鼠腹部按摩装置。在这项研究中，我们介绍了一种旨在克服这些限制的新型腹部按摩设备。与传统技术相比，该设备具有显着优势，包括运行稳定、精确控制按摩参数、减少动物压力和提高可重复性。此外，其经济高效的设计增强了代谢疾病研究中更广泛应用的可及性。通过将现代工程与传统治疗方法相结合，该设备填补了 T2DM 非侵入性实验方法的关键空白。

这种方法有助于更广泛的关于 T2DM 无创治疗技术的文献，特别是那些源自传统中医 （TCM） 的文献，它强调腹部按摩对消化和代谢功能的调节作用。研究人员可能会发现这种方法特别适合于 T2DM 和其他代谢紊乱的非药物干预研究。通过解决关键的实验挑战，该方法为推进该领域的临床和转化研究奠定了基础。

研究方案

所有动物实验均经南京中医药大学动物护理与使用专业委员会批准（批准号：202409A033）。在这里，选择了 24 只 SPF 级健康雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄为 8 周，体重为 22 g ± 2 g。将小鼠在 20-22 °C 的温度和 45%-50% 的相对湿度下进行 12 小时的光照/黑暗循环。这些动物可以免费获得食物和水。

1. T2DM 小鼠模型的建立

1. 给小鼠喂标准食物 1 周，以适应动物设施中的新环境。1 周后，使用随机数字表将 24 只 C57BL/6J 小鼠随机分为对照组（6 只小鼠）和 T2DM 模型组（18 只小鼠）。给对照组提供纯化的标准食物，而 T2DM 模型组接受高脂肪饮食。继续节食 6 个月。
2. 监测小鼠在此期间的饮水、进食、体重、空腹血糖和随机血糖。如果连续两次血糖读数超过 7.8 mM/L，请进行胰岛素耐量试验 （ITT）。将曲线下面积 （AUC） 的值大于 35 视为成功的 T2DM 模型。
3. 一旦 T2DM 模型稳定下来，就开始干预。

2. 小鼠的分组和治疗

1. T2DM 建模成功后，使用随机数字表将 T2DM 小鼠随机分配到以下组之一，以确保无偏倚选择：模型组、二甲双胍组和腹部按摩组，每组 6 只小鼠。
2. 不对对照组进行干预。使用随机数表将每只小鼠分配到其中一个实验组，确保各组在初始体重和葡萄糖水平方面具有可比性，以最大限度地减少分配中的偏差。
3. 在整个实验过程中给模型组喂食高脂肪饮食，每天通过管饲法施用 0.2 mL 生理盐水，每天 1 次，每周 6 天，持续 8 周。
4. 在整个实验过程中，给二甲双胍组喂食高脂肪饮食。研磨二甲双胍片剂并溶解用于管饲法给药，每天一次，200 mg/kg/天，用生理盐水稀释至 0.2 mL。每周 6 天，每天 1 次，持续 8 周。
5. 对于腹部按摩组，在整个实验过程中喂食高脂肪饮食。每天用 0.2 mL 生理盐水灌饲小鼠。给药 5 分钟后进行一次腹部按摩。每周在固定时间进行 6 次腹部按摩干预，休息一天，连续 8 周。
   1. 使用自制的啮齿动物限制器固定老鼠，露出它们的腹部，同时确保它们保持冷静进行腹部按摩。
   2. 参考小鼠穴位图，定位神阙穴和天书穴。以神阙到天枢的距离为半径，以每分钟 100-120 次的速度进行顺时针旋转按摩 30 分钟。干预期间施加的压力范围为 0.1-0.3 N/cm。使用 FPS 压力测试系统将压力调整到小鼠可以承受的水平，同时保持冷静和监测。

3. 准备腹部按摩训练器

1. 准备一块 1 毫米厚的聚丙烯板来制作固定板，将其塑造成一个半圆，一侧半径为 4.5 厘米，另一侧半径为 3 厘米。展开后，它形成一个梯形，上底 8 厘米，下底 10 厘米，边长 10 厘米。使用透明板观察鼠标的固定情况，如图 1A-C 所示。
2. 根据小鼠的大小，在固定板上打四个长孔，如图 1A 所示。
3. 准备一种柔软耐用的无纺布，将其切成椭圆形，中心有四条细长的直条，作为固定布。确保长而直的条带可以穿过板上的四个细长孔。根据鼠标的大小，在布条上切出四个圆孔，让鼠标的肢体穿过，如图 1B 所示。
4. 根据鼠标的腹部大小选择压敏膜传感器，并将压膜贴在与小鼠腹部相对应的固定布部分。将薄膜连接到压力监测装置，如图 1D 所示。

4. 腹部按摩程序

1. 将固定布的四条长条穿过固定板上的孔，形成一个鼠标可以轻松通过的通道。
2. 将鼠标放在半径为 4.5 厘米的一侧，利用其挖洞本能鼓励它向半径为 3 厘米的一侧移动，如图 2A 所示。
3. 从透明固定板的背面观察鼠标的位置。当鼠标到达适当位置时，拧紧四条布条，将鼠标绑在固定布的中央部分。将条带打结以固定鼠标。
4. 将固定板翻转过来，用镊子将鼠标四肢从固定布的 4 个圆孔中拉出，以进一步固定鼠标，如图 2B 所示。
5. 用一只手握住板，将固定的鼠标设备放在手掌中，使鼠标仰卧。用拇指对小鼠的腹部进行腹部按摩。在此过程中，密切监测压力监测设备上的值，以确保施加在小鼠腹部压力膜传感器上的力保持恒定和均匀，如图 2C - D 所示。
   1. 如果小鼠的鼻子和嘴唇在腹部按摩过程中出现紫色，则可能表明固定布太紧，导致缺氧。在这种情况下，请立即停止程序，松开布条，然后释放鼠标以从缺氧中恢复。
   2. 在腹部按摩过程中，小鼠可能会更频繁地排便或排尿，这是对腹部按摩的正常反应。执行及时清洁。
6. 腹部按摩 20 分钟后，松开布条上的结，让鼠标从固定装置中解脱出来。
7. 小鼠适应腹部按摩后，该过程应安静地进行，尽量减少挣扎。如果鼠标过度挣扎，请检查设备是否有问题，例如固定板破损或固定布料过紧。在整个过程中持续监测鼠标的舒适度和生命体征。
8. 实验完成后称重动物并进行血糖读数。

结果

根据上述方案，小鼠的腹部保持固定，相对固定的位置让小鼠保持稳定的姿势。以固定频率按摩腹部，按摩的压力和持续时间控制在可控范围内。这种方法类似于中医中的传统腹部按摩¹²。通过遵循此干预计划，可以适当延长干预时间，有助于小鼠适应训练，减轻其不适，有助于标准化实验程序，从而提高实验效率。

腹部按摩...

讨论

腹部推拿是中医推拿中具有代表性的基本技术，广泛应用于临床预防和治疗各种系统疾病，特别是调理和护理脾胃消化系统13,14,15。腹部按摩直接影响人体表面，覆盖大部分腹部穴位，包括中完（CV12）、良门（ST21）、神阙（CV8）、天舒（ST25）、观元（CV4）和气海（CV6）。该技术不仅刺激腹部表面穴位...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-density lipoprotein cholesterol assay kit	A112-1-1	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Low-density lipoprotein cholesterol assay kit	A113-1-1	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Metformin tablets		Sino-US Shanghai Squibb Pharmaceutical Co
Pressure Thin Film Sensors	FSR16	Vickers Electronic Technology (Luoyang) Co.
Retainer sleeve		No special requirement，Preferably, the material should be PP.
Strips of cloth for fixing		1mm thick, unfolded to a trapezoidal shape with an upper base of 8cm, a lower base of 10cm and two waists of 10cm.
Total cholesterol assay kit	A111-1-1	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Triglyceride assay kit	A110-1-1	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute