肌动蛋白共沉淀测定;​​ F -肌动蛋白结合蛋白分析

摘要

蛋白质结合丝状肌动蛋白通过不同的肌动蛋白结合模块（F - actin的）。在这个视频中，我们共同沉淀，这是一个经常使用的分析，结合F -肌动蛋白的蛋白质或特定域在体外实验证明肌动蛋白的过程。

摘要

细胞内的肌动蛋白细胞骨架的微丝网络，使细胞和细胞进程的运动，而产生的紧张局势，并有助于保持细胞形态。虽然肌动蛋白细胞骨架是一个刚性的结构，它是一个动态的结构，不断重塑。一些蛋白质可以结合到肌动蛋白细胞骨架。 F - actin的一种特定的蛋白质结合通常需要支持细胞生物学的观察，或进一步了解由于肌动蛋白细胞骨架重塑的动态过程。肌动蛋白共沉淀实验是在体外实验中通常用来分析特定的蛋白质或F -肌动蛋白结构域的结合。检测的基本原则，包括与F -肌动蛋白（孵化全长或域），超速离心沉淀的F -肌动蛋白和合作与F -肌动蛋白沉积的蛋白质的分析步骤。肌动蛋白的共沉淀实验可以设计相应的措施，肌动蛋白的亲和力和竞争分析。

研究方案

1。肌动蛋白的制备

在这个实验中使用的肌动蛋白的来源是从骨架公司股票在10毫克/毫升-70℃冷冻保存等分获得的非肌肉的人血小板（β-肌动蛋白）。肌动蛋白检测，稀释至0.4毫克/毫升含有5毫米的Tris pH值8， _氯化钙 0.2毫米，0.2毫米ATP和0.5毫米的DTT，4℃离心10分钟，在20000克的缓冲上清，这是单体肌动蛋白聚合。另外50 mM的氯化钾，1毫米的ATP和2毫米MgCl _2的诱导肌动蛋白聚合。在室温下发生聚合1小时。

2。蛋白质的制备

在这个实验中，我们使用的塔林，已作为一个GST标签的蛋白质纯化的C -末端。在实验中使用的蛋白质是经过高速离心聚合前明确孵化前F -肌动蛋白。
纺在贝克曼超速离心机在10万克的蛋白质是在22 ° C 20分钟

3。肌动蛋白的蛋白质孵化

在检测肌动蛋白和蛋白的数量会有所不同。在这个例子中，我们使用的是多余的肌动蛋白。通常情况下，摩尔比计算，例如。 4:1的摩尔比的肌动蛋白的蛋白质。

在下面的实验，最终反应体积为150μL。其中的蛋白质和F -肌动蛋白孵育的缓冲区，将取决于要测试的蛋白质和所需的条件。在这个例子中，我们使用了一个缓冲区，其中包含10毫米的Tris pH值7.0，1 mM的ATP，0.2毫米数码地面电视，EGTA 1毫米，0.1毫米_氯化钙和氯化镁₂ 2毫米。蛋白质和F -肌动蛋白孵育在室温下1小时的缓冲。

4。 F -肌动蛋白的沉淀

潜伏期之后，纺100,000克样品，在22 ° C。我们使用视频贝克曼超速离心机。转子小心取下，以免干扰颗粒。

5。与F -肌动蛋白的蛋白质共同沉淀分析

上清液小心删除到Eppendorf管和5 × Laemmli的SDS - PAGE样品缓冲液吹打。一个适当的量是1 + X Laemmli的SDS - PAGE样品缓冲液加入到剩余的微丸，吸管上下，并转移到新的Eppendorf管中。他们SDS - PAGE和考马斯亮蓝染色的凝胶或免疫印迹分离后，颗粒和上清液中蛋白质的相对含量进行了分析。

为了确定蛋白质相互作用的特殊性，肌动蛋白与肌动蛋白浓度依赖的合作sedimentations可以执行。对于这种实验中，固定数额的蛋白质和肌动蛋白的数量不断增加的一系列培养，并进行分析如上所述。

讨论

肌动蛋白共沉淀是一个简单分析F -肌动蛋白结合specfic蛋白在体外试验。在这个视频中，我们展示了一个简单的肌动蛋白可以进行合作沉淀的一个例子。我们将展示如何准备F -肌动蛋白，准备要测试的蛋白和肌动蛋白的共同沉淀的过程。开展肌动蛋白共同沉淀分析时应该考虑的若干要点。例如，孵化缓冲组件可以进行测试，pH值，温度和盐的浓度可能会影响到F -肌动蛋白结合蛋白的不同而有所不同。我们已经证明?...