アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

要約

タンパク質は、異なるアクチン結合モジュールを介して繊維状アクチン（F -アクチン）に結合する。このビデオでは、in vitroアッセイで日常的にF -アクチンを結合するタンパク質または特定のドメインを分析するために使用されているアクチンの共堆積、の手順を示しています。

要約

細胞内のアクチン細胞骨格は細胞と細胞プロセスの動きを可能にするアクチンフィラメントのネットワークであり、それは緊張を生成し、細胞の形状を維持するのに役立ちます。アクチン細胞骨格が剛構造であるが、それは絶えず改造された動的な構造です。タンパク質の数は、アクチン細胞骨格に結合することができる。 F -アクチンへの特定のタンパク質の結合は、しばしば、細胞生物学的な観察をサポートするために、またはさらに、アクチン細胞骨格のリモデリングによる動的なプロセスを理解することが望まれている。アクチンの共沈降アッセイは、in vitroアッセイで日常的にF -アクチンと特異的タンパク質またはタンパク質ドメインの結合を分析するために使用される。アッセイの基本原則は、F -アクチンと目的のタンパク質のインキュベーション（の全長またはドメイン）、F -アクチンとの共沈降タンパク質のペレットF -アクチンと分析への超遠心ステップを含む。アクチンの共沈降アッセイはアクチン結合親和性との競合アッセイを測定するためにそれに応じて設計することができます。

プロトコル

1。アクチンの調製

このアッセイで使用されているアクチンのソースを10 mg / mlで細胞骨格（株）株式のアリコートから得られた非筋ヒト血小板（β-アクチン）は-70 º Cの冷凍庫に保管されていた。アッセイのために、アクチンは、4℃で10分間、20,000 gで遠心分離5mMトリスpHが8を含有する緩衝液で0.4 mg / mlの、0.2mMのCaCl _2を 、0.2mMのATP、0.5 mMのDTT、に希釈され単量体アクチンである上清は、重合される準備ができています。アクチンの重合は、さらに50mMの塩化カリウム、1mMのATP及び2mMのMgCl ₂により誘導される。重合は、1時間室温で発生します。

2。タンパク質の調製

このアッセイでは、我々は、GST -タグタンパク質として精製されているタリンのC末端を、使用しています。アッセイに用いるタンパク質はF -アクチンとの凝集体のプレ明確なインキュベーション前に高速遠心分離に供される。
タンパク質は22℃で20分間ベックマン超遠心機で100,000 gでスピンされ

3。アクチンタンパク質のインキュベーション

アッセイにおけるアクチンとタンパク質の量が変わります。この例では、過剰にアクチンを使用しています。通常は、モル比は、例えば、計算されます。タンパク質へのアクチンの4:1のモル比。

以下のアッセイでは、最終反応容量は150μlです。蛋白質とF -アクチンをインキュベートされるバッファは、テストされ、必要な条件にする蛋白質に依存します。この例では、我々は、10mMトリスpH 7.0、1mMのATP、0.2mMのDTT、1mMのEGTA、0.1mMのCaCl ₂及び2mMのMgCl _2を含むバッファーを使用してください。蛋白質とF -アクチンは、室温で1時間バッファー中でインキュベートする。

4。 F -アクチンの沈降

インキュベーション後、サンプルを22 º Cで10万gでスピンされています我々はビデオでベックマン超遠心機を使用してください。ローターは、慎重にペレットを崩さないようにしないように削除されます。

5。 F -アクチンとの蛋白質の共沈降の分析

上清を注意深くエッペンドルフチュー​​ブにピペッティングにより除去され、5 × LaemmliのSDS - PAGEサンプル緩衝液を加えています。 1の適切な量X LaemmliのSDS - PAGEサンプルバッファーは、残りのペレットに加え、最大ピペッティングし、ダウン、と新しいエッペンドルフチュー​​ブに転送されます。ペレットと上清中のタンパク質の相対量は、SDS - PAGEとゲルやウェスタンブロッティングのクマシーブルー染色によるそれらの分離に続く分析されます。

アクチンとタンパク質の相互作用の特異性を決定するために、アクチン濃度依存共同sedimentationsを行うことができます。実験、タンパク質の固定量とアクチンの増加量の一連のこの種のインキュベートされ、そして上記のような解析が行われます。

ディスカッション

アクチンの共沈降は、F -アクチンへの結合specficタンパク質を解析するin vitroアッセイ簡単です。このビデオでは、我々は単純なアクチンの共沈降を行うことができる方法の一例を示す。我々は、F -アクチンを準備する方法を示し、試験されるタンパク質とアクチンの手続き共同沈降を準備。アクチンの共沈降アッセイを行う際のポイントの数を考慮する必要があります。例えば、インキュベーション用緩衝?...