半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚合

摘要

sdd的年龄是一个有用的技术检测和表征状聚合物在细胞中的淀粉样蛋白。在这里，我们展示了一个适应，使这种技术适合大规模应用。

摘要

淀粉样蛋白聚集与大量的蛋白质错误折叠的病理学和朊病毒传染病属性的基础，这是conformationally自我模板，被认为是低等生物的有益作用的蛋白质。淀粉样已经非常困难的，由于其不溶性和结构异质性研究。然而，根据大小和洗涤剂不溶性的淀粉样聚合物分辨率可以通过半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳（SDD - AGE）。这种技术是发现淀粉样蛋白的构象变体的检测和表征的广泛使用。在这里，我们展示了一种适应这种技术，有利于大规模的应用，如新的朊病毒和其他淀粉样蛋白的屏幕，它的使用。新的SDD年龄的方法使用毛细管传输提供更高的可靠性和易用性，并且可以容纳任何大小的凝胶。因此，大量的样品，准备从细胞或纯化蛋白质，可同时处理SDS不溶性标签蛋白的构象存在。

研究方案

第1部分：准备凝胶

1. 组装凝胶铸造托盘。水平DNA电泳的标准设备都可以使用。对于大量样品，我们准备了一个20厘米× 24厘米，最多四个50梳子板。确保铸坯没有划痕，因为这些扭曲的印迹图像。
2. 创建1X TAE在1.5％琼脂糖溶液（中等或高的凝胶强度，低的平等就业机会）。体积应足以完全淹没梳齿 - 您将要载入尽可能最大限度地提高检测的样品。微波的混合物，直到琼脂糖完全溶解。
3. 快速添加SDS的0.1％，10％的股票。涡流来混合。如果一些琼脂糖凝固在这一步，溶解使用热板和小心，以避免沸腾。
4. 倒入铸造托盘的解决方案。用梳子耙出任何气泡，后来，因为它们可能干扰与传输。
5. 凝胶成立后，除去梳子和凝胶放入凝胶罐。完全淹没在1X TAE凝胶含有0.1％SDS。

第2部分：准备样品

1. 对于高通量分析酵母细胞裂解液中，我们开始成长快速搅拌过夜96块2毫升文化。在这种情况下，每一种文化的高表达有兴趣的蛋白质。分析低丰度蛋白质时，必须使用较大的文化卷
2. 于2000年在室温下5分钟的离心力离心收获细胞。
3. 再次重悬细胞在水和离心机。
4. 悬浮在1毫升spheroplasting溶液。约30分钟的孵育在30 ° C（你可以通过显微镜确认spheroplasting效率）。
5. 在室温下5分钟800离心力离心。完全去除上清液。
6. 在100毫升裂解液重悬沉淀的原生质球。
7. 封面用胶带和2分钟的高速涡块。
8. 2分钟，在4000离心力的颗粒细胞碎片。
9. 小心取出上清液到一个新的容器，例如，一个96孔PCR板。
10. 如果需要，确定的裂解液中的蛋白浓度。
11. 4X样品缓冲液加入样品产生裂解液中含有1X样品缓冲。孵育在室温下5分钟。
12. 负载凝胶。如果需要，可以节省一半的样本量和煮沸SDS - PAGE分析。为了监测转移的程度以后，包括预染SDS - PAGE电泳标记。此外，分子量非常大的蛋白质（例如，鸡胸大肌提取物）组成的标记，可以被用来估计解决复合物的大小。
13. 运行在低电压（≤3 V / cm时的凝胶长度），直到染料前沿到达凝胶月底〜1厘米。这将需要几个小时。重要的是，凝胶保持冷静，否则低分子量蛋白质（例如，单体）的扩散，可以限制他们的检测。
    

第3部分：传输

1. 剪下一块硝化棉凝胶相同的尺寸。
2. 20件GB004和GB002吸墨纸8件，切割凝胶相同的尺寸。削减GB004额外的一块，作为灯芯，它长约20厘米，比凝胶广泛。
3. 沉浸在1X TBS的硝化棉，灯芯，和4件GB002。
4. 在一个塑料容器，组装一叠论文如下：20件干GB004，干GB002 4件，然后一件预湿GB002。栈顶奠定硝化棉。
5. 凝胶在水中的托盘简要铸造冲洗，以除去多余的运行缓冲。然后，仔细地开始滑落到堆栈上的托盘凝胶。托盘滑出凝胶，扑灭膜用TBS必要的。额外的缓冲区，有助于防止气泡被困下的凝胶。一个移液管工程以及用于这一目的。
6. 后凝胶已被移动到堆栈，查深查透的气泡。如果有任何存在，解除凝胶的边缘，并重新申请缓冲区，直到气泡可以算出。
7. 其余三个预湿GB002件放在凝胶顶部。确保坚决整个堆栈的顶部滚动吸管彻底层之间的所有接触。
8. 侧翼转栈包含TBS电视台的两条高架托盘。披风预湿灯芯，灯芯两端是在TBS电视台淹没整个堆栈。
9. 盖上塑料轴承额外的重量（例如，一瓶500毫升的水）的一个额外的托盘组装的转栈。
10. 允许转让进行至少三个小时，或隔夜。
11. 转让后，膜可以处理标准的免疫印迹。

Spheroplasting解决方案
1.2米的D -山梨醇
0.5毫米氯化镁₂
20毫米的Tris，pH值7.5
50 mM的生物医学工程（补充新鲜）
0.5毫克/毫升Zymolyase 100T（补充新鲜）

coration：“裂解液
100毫米的Tris 7.5
50 mM氯化钠
10毫米生物医学工程（补充新鲜）
蛋白酶抑制剂（补充新鲜）

4X采样缓冲器
2X栓塞
20％的甘油
8％SDS
溴酚蓝偏好

讨论

SDD - AGE Kryndushkin等人首次报道^1，研究SDS耐配合物[PSI +]朊蛋白在酵母中，至今发现的广泛使用，研究朊病毒和非朊病毒^聚合 2-9 。但是，转移到膜上以下的琼脂糖凝胶电泳的蛋白质是有问题的的，可以在一个扭曲的印迹^图像 5的结果。此外，最常用的淹没electroblotting技术引入实际凝胶的大小限制，因此可处理的样品的数量。我们已经解决了这些问题，由用人向下毛细管^转移 10，一个简单的程序，它使用一摞干印迹文件蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。毛细管转移防止失真，并可以轻松地处理大量凝胶。有几件事情之前要考虑使用的SDD年龄。原油样品（例如，裂解液），特定蛋白的免疫检测是必要的。 SDD - AGE不完全变性的蛋白复合体的利益，所以必须承担被检测到的蛋白（S）淀粉样地区以外的抗原表位标记。裂解液可以一般准备，因为他们将一个正常的SDS - PAGE，有两个重要的区别。首先，增加了必须小心，以防止蛋白水解降解。这里使用的部分变性条件是不够的灭活蛋白酶，也可以使靶蛋白更容易水解。至少2倍的推荐浓度使用一个完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。其次，加热的样品应避免。如果所有的单体阴性对照需要，例如，以确认高分子量物种得不到应有的共价修饰，一个孵育10分钟，在95 ° C可以使用，这将恢复最淀粉样蛋白单体。

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
zymolyase 100T		Seikagaku America	120493-1
Halt Protease Inhibitor Cocktail		Thermo Scientific	78429
Hybond-C extra nitrocellulose		Amersham	RPN303E
GB004 blotting paper		Whatman	10427926
GB002 (3MM Chr) blotting paper		Whatman	3030-917
Agarose (UltraPure)		Invitrogen	15510-027