Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Резюме

SDD-AGE является полезным методом для обнаружения и характеризации амилоид-подобных полимеров в клетках. Здесь мы показываем, адаптации, что делает эту технику поддаются крупномасштабных приложений.

Аннотация

Амилоида агрегации связано с многочисленными неправильного фолдинга белков и лежит в основе патологии инфекционных свойств прионы, которые являются конформационно самостоятельно шаблонов белки, которые, как считается, оказывают благотворное ролей в низших организмов. Амилоиды были трудны для изучения из-за их неразрешимости и структурные неоднородности. Тем не менее, разрешение амилоидных полимеров в зависимости от размера и моющих средств нерастворимость стало возможным по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE). Эта техника находит широкое применение для выявления и характеристики амилоидных конформационных вариантов. Здесь мы демонстрируем адаптации этой технологии, что облегчает его использование в крупномасштабных приложений, таких как экраны для романа прионы и других амилоидогенный белков. Новые SDD-AGE метод использует капиллярную передачи для большей надежности и простоты использования, и позволяет любому размеру гель быть размещены. Таким образом, большое количество образцов, полученных из клеток или очищенные белки, могут быть обработаны одновременно на наличие SDS-нерастворимых конформеров меченых белков.

протокол

Часть 1: Подготовка гель

1. Соберите лоток гель литья. Стандартное оборудование для горизонтального электрофореза ДНК могут быть использованы. Для большого количества образцов, мы готовим 20 см х 24 см плита с четырьмя 50-а гребни. Убедитесь, что плита не имеет царапин, так как они могут искажать пятно изображения.
2. Создать 1,5% агарозном решение (средний или высокий гель-прочность, низкая РВЗ) в 1X TAE. Объем должен быть достаточно, чтобы полностью погрузить в воду гребень зубы - вы хотите загрузить столько образец, как можно максимально обнаружения. Микроволновая смесь, пока агарозном полностью не растворится.
3. Быстро добавить SDS до 0,1% с 10% акций. Swirl перемешать. Если некоторые агарозном застывает на этом этапе, растворяться использованием горячей плите и будьте осторожны, чтобы избежать кипения.
4. Залейте раствор в литье лоток. Используйте расческу разгребать любые пузыри, так как они в дальнейшем могут помешать передаче.
5. После гель установил, удалить гребни и место гель в гель бак. Полностью погрузиться геля в 1X TAE, содержащем 0,1% SDS.

Часть 2: Подготовка образцов

1. Для высокой пропускной анализ дрожжей лизатов, мы начинаем с 2-мл культуры выращивали в течение ночи с быстрым агитации в 96-и блоков. В этом случае, каждая культура гиперэкспрессией белка интересов. При анализе белков низкого изобилия, больших объемов культура должна быть использована
2. Урожай клетки центрифугированием при 2000 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют клетки в воде и центрифуга снова.
4. Ресуспендируют в 1 мл spheroplasting решение. Инкубируйте в течение примерно 30 минут при 30 ° С (Вы можете подтвердить spheroplasting эффективность микроскопия).
5. Центрифуга при 800 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре. Полностью удалить супернатант.
6. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в 100 мл буфера для лизиса.
7. Крышка блока с лентой и вихря на высокой скорости в течение 2 мин.
8. Гранул распада клеток при 4000 RCF в течение 2 мин.
9. Осторожно удалите супернатант в новый контейнер, например, 96-луночного ПЦР пластины.
10. При необходимости определения концентрации белка лизатов.
11. Добавить 4X буфера образца образцы для получения лизатов содержащие 1X образец буфера. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
12. Нагрузка геля. При желании, сохранить половину объема образца и варить на SDS-PAGE анализа. Для того, чтобы контролировать степень передачи позже, включают предварительно окрашенные SDS-PAGE маркером. Кроме того, маркер молекулярного веса, состоящие из очень большого белки (например, куриные грудной экстракта) может быть использована для оценки размеров решены комплексы.
13. Выполнить при низком напряжении (≤ 3 В / см длины геля) до красителя перед достигает ~ 1 см от конца геля. Это займет несколько часов. Важно, что гель остается прохладным, в противном случае диффузии низкомолекулярных белков весом (например, мономеры) может ограничить их обнаружения.
    

Часть 3: Трансфер

1. Отрежьте кусок нитроцеллюлозы к тому же размеры, как и гель.
2. Сокращение на 20 частей GB004 и 8 частей GB002 промокательной бумаги, к тому же размеры, как и гель. Вырезать дополнительная часть GB004 для использования в качестве фитиля; сделать его примерно на 20 сантиметров шире, чем гель.
3. Погрузите нитроцеллюлозы, фитиль и 4 части GB002 в 1X TBS.
4. В пластиковом контейнере, собрать кипу бумаг следующим образом: 20 штук сухих GB004, то 4 части сухой GB002, то одна часть предварительно мокрой GB002. Положите нитроцеллюлозы на вершине этого стека.
5. Промойте гель на литье лоток кратко в воде, чтобы удалить лишнюю работает буфера. Затем, осторожно начинает скользить гель с лотка в стек. Передвигая гель от лотка, потушить мембраны с TBS по мере необходимости. Дополнительный буфер помогает предотвратить пузыри стать оказавшиеся под гелем. Передачи пипетки хорошо подходит для этой цели.
6. После геля была перемещена в стек, тщательно проверить на пузыри. Если таковые имеются, поднимите край геле и повторно буфер, пока пузырьки могут быть выработаны.
7. Положите оставшиеся три предварительно смачивается GB002 штук на верхнюю часть геля. Достаточная контактов между всеми слоями путем прокатки пипетки твердо в верхней части стека.
8. Пашина передачи стек с двумя лотками содержащие повышенные TBS. Пелерина предварительно мокрой фитиль через стек, что либо конец фитиля погружают в TBS.
9. Обложка собраны передачи стек дополнительный лоток пластмассового подшипника лишний вес (например, 500 мл бутылки воды).
10. Разрешить передачу проводили в течение не менее трех часов, или на ночь.
11. После передачи, мембраны могут быть обработаны стандартной западной промокательной.

Решение Spheroplasting
1,2 М Д-сорбитол
0,5 мМ MgCl ₂
20 мМ Трис, рН 7,5
50 мМ BME (добавить свежие)
0,5 мг / мл Zymolyase 100T (добавить свежие)

coration: подчеркнуть; "> Лизис буфера
100 мМ Трис 7,5
50 мМ NaCl
10 мМ BME (добавить свежие)
ингибиторы протеаз (добавить свежие)

4X буфера Пример
2X ТАЕ
20% глицерина
8% SDS
бромфенола синий со своими предпочтениями

Обсуждение

SDD-AGE было впервые сообщено Kryndushkin и соавт. ^1, для изучения SDS-устойчивые комплексы [PSI +] прионов в дрожжах, и с тех пор нашел широкое применение как изучение прионов и не прионных агрегатов ^2-9. Тем не менее, передача белков мембраны следующие электрофореза в геле агарозы проблематично, и может привести к искажению изображения пятно ^5. Кроме того, погруженные electroblotting техника наиболее часто используется вводит практические ограничения на размер геля и, следовательно, количество образцов, которые могут быть обработаны. Мы рассматривали эти проблемы, используя вниз капиллярной передачи ^10, простая процедура, которая использует стек сухого промокательной бумаги передачи белков из геля на нитроцеллюлозные мембраны. Капиллярный перенос предотвращает искажения и позволяет крупным гели для обработки легко. Есть несколько вещей, чтобы рассмотреть, прежде чем использовать SDD-AGE. Для сырой образцы (например, лизатов), иммунодетекции специфических белков необходимо. SDD-AGE не в полной мере денатурации белковых комплексов интерес, поэтому белок (ы) для обнаружения должны нести эпитопа теги вне амилоидогенный регионе. Лизаты в общем случае может быть подготовлен как они были бы для нормального SDS-PAGE, с двумя важными отличиями. Во-первых, увеличилась необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить деградацию путем протеолиза. Частично денатурирующих условиях используется здесь не достаточно для инактивации протеиназы, а также может сделать белков-мишеней более восприимчивы к протеолиза. Используйте полный коктейль ингибиторов протеаз по крайней мере в два раза рекомендованной концентрации. Во-вторых, нагревание образцов следует избегать. Если все-мономера отрицательного контроля требуется, например, чтобы подтвердить, что высоким молекулярным весом виды не из-за ковалентные модификации, 10-минутной инкубации при 95 ° С может быть использован, который восстановит самые амилоиды на мономерные белки.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
zymolyase 100T		Seikagaku America	120493-1
Halt Protease Inhibitor Cocktail		Thermo Scientific	78429
Hybond-C extra nitrocellulose		Amersham	RPN303E
GB004 blotting paper		Whatman	10427926
GB002 (3MM Chr) blotting paper		Whatman	3030-917
Agarose (UltraPure)		Invitrogen	15510-027