La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Resumen

SDD-AGE es una técnica útil para la detección y caracterización de polímeros como el amiloide en las células. Aquí se demuestra una adaptación que hace que esta técnica susceptible de aplicaciones a gran escala.

Resumen

Agregación amiloide se asocia con numerosas patologías mal plegamiento de proteínas y es la base de las propiedades de los priones infecciosos, que se auto-conformación de plantillas de las proteínas que se cree que tienen un papel beneficioso en los organismos inferiores. Amiloides han sido muy difíciles de estudiar debido a su insolubilidad y la heterogeneidad estructural. Sin embargo, la resolución de los polímeros de amiloide en función del tamaño y la insolubilidad de detergente ha sido posible gracias a Semi-desnaturalización de detergente-geles de agarosa (SDD-AGE). Esta técnica es encontrar amplio uso para la detección y caracterización de variantes conformacionales de amiloide. Este sentido, demuestran una adaptación de esta técnica que facilita su uso en aplicaciones a gran escala, como las pantallas de los priones y otras proteínas novela amiloidogénica. El nuevo SDD-AGE método utiliza la transferencia capilar para una mayor fiabilidad y facilidad de uso, y permite a cualquier tamaño de gel para ser acomodados. Por lo tanto, un gran número de muestras, preparadas a partir de células o proteínas purificadas, se pueden procesar simultáneamente la presencia de SDS-insoluble conformadores de proteínas etiquetadas.

Protocolo

Parte 1: Preparación del gel

1. Montar la bandeja de fundición de gel. El equipo estándar para la electroforesis de ADN horizontal se puede utilizar. Para un gran número de muestras, nos preparamos a 20 cm x 24 cm losa con un máximo de cuatro de 50 y peines. Asegúrese de que la losa no tiene arañazos, ya que pueden distorsionar la imagen blot.
2. Crear una solución de agarosa 1,5% (medio o alto gel resistencia y bajo EEO) en 1X TAE. El volumen debe ser suficiente para sumergir completamente los dientes del peine - que se desea cargar de la muestra tanto como sea posible para maximizar la detección. Microondas la mezcla hasta que la agarosa se disuelva por completo.
3. Suma rápida SDS al 0,1% de una reserva de 10%. Agitar para mezclar. Si algunos de agarosa solidifica durante este paso, disolver con un plato caliente y tener cuidado para evitar una ebullición.
4. Vierta la solución en la bandeja de fundición. Utilice un peine de rastrillo de las burbujas, ya que más tarde podrían interferir con la transferencia.
5. Después de gel, quite los peines y colocar el gel en el depósito de gel. Sumerja completamente el gel en 1X TAE conteniendo 0,1% SDS.

Parte 2: Preparación de muestras

1. De alto rendimiento para el análisis de los lisados ​​de levadura, se inicia con las culturas de 2 ml crecido durante la noche con agitación rápida en 96 pozos bloques. En este caso, cada cultura es una sobreexpresión de la proteína de interés. Al analizar las proteínas de baja abundancia, grandes cantidades de cultivos debe ser utilizado
2. Las células de la cosecha por centrifugación a 2000 rcf durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Resuspender las células en el agua y se centrifuga de nuevo.
4. Resuspender en 1 ml de solución spheroplasting. Se incuba durante aproximadamente 30 minutos a 30 ° C (se puede confirmar la eficiencia spheroplasting por microscopía).
5. Centrifugar a 800 RCF durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar completamente el sobrenadante.
6. Resuspender esferoplastos pellets en 100 ml de solución amortiguadora de lisis.
7. Cubrir el bloque con la cinta y el vórtice de alta velocidad durante 2 min.
8. Precipitado celular escombros en 4000 rcf durante 2 min.
9. Retire con cuidado el sobrenadante a un nuevo contenedor, por ejemplo, una placa de 96 pocillos PCR.
10. Si lo desea, determinar la concentración de proteínas de los lisados.
11. Añadir la muestra de amortiguación 4X a las muestras para generar lisados ​​que contienen 1X tampón de la muestra. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
12. Carga de gel. Si lo desea, guarde la mitad del volumen de la muestra y hervir durante análisis SDS-PAGE. Con el fin de monitorear el grado de transferencia más adelante, incluye un pre-SDS-PAGE teñido marcador. Además, un marcador de peso molecular que consiste en proteínas de gran tamaño (por ejemplo, pollo pectoral extracto) se puede utilizar para calcular los tamaños de los complejos de resolver.
13. Funcionar a baja tensión (≤ 3 V / cm la longitud del gel) hasta que el frente tinte alcance aproximadamente 1 cm del extremo del gel. Esto puede durar varias horas. Es importante que el gel de mantener la calma, de lo contrario la difusión de proteínas de bajo peso molecular (por ejemplo, los monómeros) puede limitar su detección.
    

Parte 3: Transferencia

1. Corte un pedazo de nitrocelulosa de las mismas dimensiones que el gel.
2. Cortar 20 piezas de GB004 y GB002 8 piezas de papel secante, con las mismas dimensiones que el gel. Cortar una pieza adicional de GB004 para ser utilizado como una mecha, que sea de unos 20 centímetros más ancho que el gel.
3. Sumergir las tiras de nitrocelulosa, mecha, y 4 piezas de GB002 en 1X TBS.
4. En un recipiente de plástico, reunir a un montón de papeles de la siguiente manera: 20 piezas de seco GB004, a continuación, cuatro piezas de GB002 seco, luego un trozo de pre-mojado GB002. Coloque las tiras de nitrocelulosa en la parte superior de la pila.
5. Enjuague el gel en la bandeja de fundición brevemente en agua para eliminar el exceso de tampón en funcionamiento. Entonces, cuidadosamente comenzar a deslizar el gel de la bandeja en la pila. Mientras desliza el gel de la bandeja, apagar la membrana con TBS según sea necesario. El buffer adicional ayuda a prevenir burbujas de quedar atrapados en el gel. Una pipeta de transferencia que funciona bien para este propósito.
6. Después de que el gel ha sido movido a la pila, revise si hay burbujas. Si están presentes, levantar el borde del gel y volver a aplicar buffer hasta que las burbujas pueden ser resueltos.
7. Puesto que los tres restantes pre-humedecida GB002 piezas en la parte superior del gel. Asegurar el contacto completo entre todas las capas de rodadura de una pipeta con firmeza en la parte superior de la pila.
8. El flanco de la pila de transferencia con dos bandejas que contienen elevados TBS. Coloque la mecha que ya húmedo en toda la pila de tal manera que cada extremo de la mecha se sumerge en TBS.
9. Cubra la pila de la transferencia de ensamblado con una bandeja de plástico adicionales que soportan el peso extra (por ejemplo, una botella de 500 ml de agua).
10. Permitir la transferencia de proceder por un mínimo de tres horas, o toda la noche.
11. Después de la transferencia, la membrana puede ser procesado por la norma de Western Blot.

Solución Spheroplasting
1,2 M D-sorbitol
0,5 mM de MgCl ₂
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (añadir nuevo)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (añadir nuevo)

coration: underline; "> Tampón de lisis
100 mM Tris 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (añadir nuevo)
inhibidores de la proteasa (añadir nuevo)

Muestra de amortiguación 4X
2X TAE
20% de glicerol
8% SDS
azul de bromofenol a la preferencia

Discusión

SDD-AGE se informó por primera vez por Kryndushkin et al. ^1, para el estudio de SDS-resistente a los complejos de la [PSI +] priones de levadura, y desde entonces ha encontrado un uso generalizado, tanto el estudio de priones y no agregados de priones ^2-9. Sin embargo, la transferencia de las proteínas a una membrana de electroforesis siguiente en un gel de agarosa es problemático, y puede resultar en una imagen distorsionada mancha ^5. Además, la técnica sumergida electroblotting más utilizado presenta limitaciones prácticas para el tamaño del gel y por lo tanto el número de muestras que pueden ser procesados. Hemos abordado estos problemas mediante el empleo de la transferencia a la baja capilar ^10, un procedimiento simple que utiliza una pila de papeles secantes secos para la transferencia de las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. Transferencia capilar evita la distorsión y permite que los geles grandes para ser procesado fácilmente. Hay algunas cosas a considerar antes de usar SDD-AGE. Para las muestras de crudo (por ejemplo, lisados), inmunodetección de proteínas específicas es necesario. SDD-AGE no es totalmente desnaturalizar los complejos de proteínas de interés, por lo que la proteína (s) para ser detectados deben llevar una etiqueta de epítopo fuera de la región amiloidogénica. Lisados ​​general, se puede preparar como se haría para un normal SDS-PAGE, con dos diferencias importantes. En primer lugar, un mayor cuidado se debe tomar para evitar su degradación por proteolisis. Las condiciones parcialmente desnaturalizantes utilizados aquí no son suficientes para inactivar las proteasas, y también puede hacer las proteínas diana más susceptibles a la proteólisis. Use un cóctel de inhibidores de proteasa completa en al menos dos veces la concentración recomendada. En segundo lugar, el calentamiento de la muestra debe ser evitado. Si un control de monómero de todos los negativos que se desea, por ejemplo, para confirmar que el alto peso molecular de especies no se deben a modificaciones covalentes, de una incubación de 10 minutos a 95 ° C se puede utilizar, lo que restaurará la mayoría de los amiloides de la proteína monomérica.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
zymolyase 100T	Seikagaku Corporation	120493-1
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78429
Hybond-C extra nitrocellulose	Amersham	RPN303E
GB004 blotting paper	Whatman, GE Healthcare	10427926
GB002 (3MM Chr) blotting paper	Whatman, GE Healthcare	3030-917
Agarose (UltraPure)	Invitrogen	15510-027