研究与基于荧光素酶的记者基因检测膜生源

摘要

在这里，我们描述基于荧光素酶报告基因的使用自Promega的双GloTM荧光素酶检测系统的方法研究细胞的吞噬功能，诱导基因表达的变化的过程。

摘要

要研究膜生物合成的过程中，协调不同的脂质合成途径，它是有用的工作与实验系统，膜生物合成和诱导的方式迅速发生。我们已经发现，细胞迅速合成膜脂，以补充失去了作为包装材料在颗粒吞噬膜池的乳胶珠的吞噬功能是为这些目的的实际。在这里，我们描述基于荧光素酶报告基因的使用自Promega双GLO的萤光素酶检测系统的方法研究细胞的吞噬功能，诱导基因表达的变化的过程。

研究方案

细胞培养

1. 人类胚胎肾293（HEK293）细胞联合文化是生长在10 - cm的文化菜“中小型一个”贝科的修改鹰的中等辅以一个抗生素鸡尾酒（100单位每青霉素毫升和100微克（DMEM）组成，每毫升硫酸链霉素）和10％胎牛血清（FBS）。
2. 要成立一个实验的细胞，中期是吸，细胞两次洗净，用5毫升磷酸缓冲液（PBS）的解决方案。
3. PBS是然后取出，用0.6毫升含0.25％胰蛋白酶溶液取代。
4. 这道菜是在37˚C的约2分钟，待细胞开始分离。
5. A加5.5毫升培养基中的胰蛋白酶和细胞与血球计数。
6. 细胞稀释至每毫升32万细胞，并在一个多聚赖氨酸包被96孔培养板每孔0.1毫升分装到。
7. 广场盘成一个组织培养箱内培养，在37˚C的大气中含有8.8％的二氧化碳，并成长为24小时。

转染

1. 在准备为转染，应考虑多少复制是要执行的每个实验条件和质粒金额将转。我们经常执行一式三份的所有条件和转染共50至100纳克每口井的质粒DNA。质粒混合，应包括至少一个记者表达萤火虫荧光素酶和控制构推的海肾荧光素酶表达质粒构建。
2. 质粒的解决方案是吸管为1.5毫升的离心管，并辅以每个样品10μL无血清和无抗生素的DMEM。例如，如果20井是每50微克DNA转染，加入200μl的DMEM 1微克DNA。
3. 的DMEM / DNA溶液，每微克DNA添加3μL试剂“地下293”（Mirus）。吹打及混合，在室温下样品的立场让至少10分钟。
4. 在此期间，从96孔培养板中删除媒体和更换新鲜培养基A.与90μL
5. 每孔添加10μL的DMEM / DNA /过境293的混合物。
6. 广场盘成一个组织培养箱内培养，在37˚C的大气中含有8.8％的二氧化碳，并成长为24小时。

吞噬作用

1. 准备中B加（1:1的DMEM和火腿的F12培养液加用抗生素和10％FBS的混合物）在零至1毫克每毫升0.75微米乳胶珠的悬浮液含有。
2. 从96孔培养板中删除媒体和取代0.1毫升珠悬浮在中等B.
3. 旋转板，在1000 × G. 2分钟
4. 细胞，然后培养在37˚C的6至16小时。根据条件和1至3小时后检测荧光素酶，增加了报告基因的表达，可以用来驱动发起人。
5. 在相同的情况下，可能有必要以珠为30至60分钟的孵育细胞，然后用PBS清洗，以消除非法人珠，前添加额外的时间内的细胞培育新媒体。

双GloTM萤光素酶检测

1. 注意：我们使用这种试剂盒的协议在某些方面不同于制造商的建议。它已被修改，以减少每个样品所需的试剂量。
2. 准备1米数码地面电视，鸿沟的解决方案，分成多个小分装和储存在-20˚C。
3. 准备一个20毫米的Tris - HCl（pH值7.8），10％（V / V）甘油，和0.5％（V / V）的Triton X - 100的裂解缓冲液中含有。在使用之前，等分实验所需的金额，并添加1μL每毫升含1米数码地面电视加蛋白酶抑制剂的鸡尾酒终浓度为0.5至1倍。不要再用剩下的数码地面电视解决方案。
4. 当首次使用双GloTM试剂盒，准备一瓶GloTM双荧光素酶底物（提供双GloTM萤光素酶缓冲瓶（套件）的全部内容传送到荧光素酶试剂（萤火虫）用试剂盒）。未使用的萤光素酶试剂分成10毫升分装保存在-20˚C。
5. 从组织文化的孵化器中取出96孔板，置于冰上。移除媒体的愿望，加入40μL，每口井的裂解缓冲液，然后离开30分钟的冰板。
6. 在一个白色的，不透明的96孔板（OptiplateTM - 96，Perkin Elmer公司的产品目录号6005290）等分15％的萤光素酶试剂，然后μL加入15μL细胞裂解液。
7. 孵育板在室温为10分钟，然后读取酶标仪发光。
8. 使用前，准备适量的海肾荧光素酶底物溶液，加入1部分双GloTM停止GLO ®试剂（试剂盒提供）双GloTM停止GLO ®缓冲液（试剂盒提供）100份。
9. 每口井的海肾荧光素酶底物溶液中添加15μL，每口井，在室温下孵育10分钟，然后再次测量发光。

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