Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

Riepilogo

Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-GloTM sistema luciferasi di analisi da Promega.

Abstract

Per studiare il coordinamento delle diverse vie di sintesi dei lipidi durante la biogenesi della membrana è utile lavorare con un sistema sperimentale in cui la biogenesi della membrana avviene rapidamente e in modo inducibile. Abbiamo scoperto che la fagocitosi di sfere di lattice è pratico per questi scopi, come le cellule in rapida sintesi di lipidi di membrana per riempire piscine membrana perso come materiale per il confezionamento durante fagocitazione delle particelle. Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-Glo sistema luciferasi di analisi da Promega.

Protocollo

Colture Cellulari

1. Colture delle risorse umane di rene embrionale 293 (HEK293), le cellule sono coltivate in 10 cm di piatti della cultura in 'medium A', composto da Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) integrato con un cocktail di antibiotici (100 unità per ml di penicillina e 100 mg per ml di solfato di streptomicina) e il 10% di siero fetale bovino (FBS).
2. Per impostare le celle di un esperimento, il mezzo è succhiare, e le cellule vengono lavate due volte con 5 ml di tampone fosfato (PBS) soluzione.
3. La PBS è poi rimosso e sostituito con 0,6 ml di una soluzione contenente 0,25% tripsina.
4. Il piatto viene incubata a 37 ˚ C per circa 2 min finché le cellule hanno cominciato a staccare.
5. 5,5 ml di terreno A è aggiunto per neutralizzare la tripsina e le celle sono contate con un emocitometro.
6. Le cellule sono diluite a 320.000 cellule per ml e dispensati a 0,1 ml per bene in un polilisina rivestite da 96 pozzetti piastra di coltura.
7. Porre la capsula in un tessuto culturale incubatore a 37 ˚ C con un'atmosfera contenente 8,8% di CO2 e far crescere per 24 ore.

Trasfezioni

1. Nella preparazione per trasfezioni, dovrebbe essere considerato quanti replica devono essere eseguite per condizioni sperimentali e quali quantità di plasmide saranno transfettate. Noi di routine eseguire tutte le condizioni in triplice copia e trasfezione un totale di 50 a 100 ng di DNA plasmidico per bene. Mescola plasmide deve includere almeno un giornalista che esprime costruire lucciola luciferasi e un plasmide luciferasi Renilla controllo esprimendo da un promotore costitutivo.
2. Le soluzioni plasmide vengono aggiunti nei tubi da 1,5 ml microcentrifuga ed integrata con 10 microlitri per ogni campione di siero e senza antibiotici senza DMEM. Per esempio, se 20 pozzi sono tutti di essere transfettate con 50 mg di DNA, aggiungere 200 ul DMEM a 1 mg di DNA.
3. Per il DMEM / DNA soluzione aggiungere 3 ml 'TransIT 293 reagente' (Mirus) per DNA mcg. Mescolare pipettando up & down e lasciare che i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 min.
4. Durante questo periodo, rimuovere il supporto dal-96 e piastra di coltura e sostituire con 90 ml di A. mezzo fresco
5. Per ogni pozzetto aggiungere 10 microlitri della DMEM / DNA / transito 293 miscela.
6. Porre la capsula in un tessuto culturale incubatore a 37 ˚ C con un'atmosfera contenente 8,8% di CO2 e far crescere per 24 ore.

Fagocitosi

1. Preparare sospensioni contenenti mezzo B (una miscela 1:1 di DMEM e Ham F12 medium più antibiotici e il 10% FBS) più 0,75 micron sfere di lattice a zero a 1 mg per ml.
2. Rimuovere il supporto dal-96 pozzetti cultura e sostituirlo con 0,1 ml di sospensioni tallone in media B.
3. Spin la piastra per 2 min a 1000 x g.
4. Le cellule sono poi coltivate a 37 ˚ C per 6 a 16 ore. A seconda delle condizioni e il promotore usato per guidare luciferasi, un aumento dell'espressione del gene reporter può essere rilevato dopo 1 a 3 ore.
5. In alcuni casi può essere necessario per incubare le cellule con perline da 30 a 60 minuti, poi fare 2 lavaggi con PBS per rimuovere perle prive di personalità giuridica, e aggiungere mezzi freschi prima incubando le cellule per ulteriori periodi di tempo.

Dual-GloTM saggio luciferasi

1. Nota: il nostro protocollo per l'utilizzo di questo kit si differenzia per alcuni aspetti da quello consigliato dal produttore. E 'stato modificato per ridurre la quantità di reagenti necessari per campione.
2. Preparare una soluzione di 1 M DTT, dividere in più piccole aliquote e conservare a -20 ˚ C.
3. Preparare un buffer di lisi contenente 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), il 10% (v / v) glicerolo, e 0,5% (v / v) Triton X-100. Prima dell'uso, aliquota una quantità necessaria per l'esperimento e aggiungere 1 ml per ml di 1 M DTT, più cocktail inibitore della proteasi per una concentrazione finale di 0,5 a 1x. Non riutilizzare la soluzione rimanente DTT.
4. Quando si utilizza il Dual-GloTM kit per la prima volta, preparare l'(lucciola) Reagente luciferasi, trasferendo l'intero contenuto di un flacone di doppio buffer GloTM luciferasi (fornito con il kit) per una bottiglia di Dual-GloTM substrato luciferasi (a condizione con il kit). Dividere il reagente utilizzato luciferasi in 10 ml aliquote e conservare a -20 ˚ C.
5. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal tessuto cultura incubatore e posizionarlo sul ghiaccio. Rimuovere il supporto per aspirazione, aggiungere 40 microlitri per pozzetto di tampone di lisi, e poi lasciare la piastra in ghiaccio per 30 min.
6. In un bianco opaco a 96 pozzetti (OptiplateTM-96, Perkin Elmer numero di catalogo 6005290) aliquota 15 microlitri per pozzetto di reagente luciferasi, e poi aggiungere 15 ml di lisato cellulare.
7. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi leggere la luminescenza in un lettore di micropiastre.
8. Immediatamente prima dell'uso, preparare una quantità appropriata di Renilla soluzione di substrato della luciferasi con l'aggiunta di 1 parte Dual-GloTM Stop & Glo ®; Reagente (fornito con il kit) per 100 parti Dual-GloTM Stop & Glo ® Buffer (fornito con il kit).
9. Per ogni pozzetto aggiungere 15 microlitri per pozzetto della soluzione di substrato Renilla luciferasi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi misurare la luminescenza di nuovo.

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