磁性活细胞分拣 （MACS）: 胸腺 T 淋巴细胞的分离

1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
2. 清洗所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后用干净的纸巾擦干。
3. 准备 200 mL 的汉克平衡盐溶液 （HBSS）， 含有 2% 的胎儿小牛血清 （FCS）。

2. 解剖

1. 将安乐死小鼠固定在解剖板上。
2. 使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术进入胸腔。
3. 取出心脏，进入位于心脏上方的胸腺。然后，识别胸腺，由两个白色叶组成，位于心脏上方的胸腔。
4. 使用钳子小心地分离胸腺，并将其放在培养皿与 5 mL 的 HBSS 2% FCS。

3. 免疫细胞分离

1. 将胸腺放在40μm细胞滤网上，放在同一个培养皿上。用柱塞粉碎胸腺，使其在同一菜中分离。
2. 分离胸腺和液体转移到15 mL离心管中。
3. 用 5 mL 的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将洗涤介质也转移到同一离心管中。
4. 在 20°C 下将管在 370 x g下离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
5. 将颗粒重新悬浮在2 mL的醋酸钾中，以赖解红细胞。等待 2 分钟，然后用 HBSS 2% FCS 将音量补至 14 mL。
6. 在 20°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
7. 使用锥蓝色染色测定估计细胞浓度，并使用适当的HBSS 2%FCS调整最终细胞浓度至10⁷细胞/mL。

4. 免疫细胞的磁性标记

1. 取两个 FACS 管。将一个管标为"非富集T细胞"，另一管"富集T细胞"，使用磁性标记分离。
2. 将细胞溶液分配到两个FACS管中。
3. 在 370 x g下将"富集 T 细胞"管在 20°C 下离心 3 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
4. 在250 μL的抗CD3生物异位抗体混合物中重新悬浮颗粒（表1，混合1）。

混合	标记试剂	稀释
1	抗CD3生物仿当抗体	1/400 （在哈佛商学院 2% FCS）
2	链球菌结合珠	1/5 （在哈佛商学院 2% FCS）
3	防 CD3 BV421	1/200 （在哈佛商学院 2% FCS）

表1:抗体混合组合。混合1和2用于磁分离。混合3用于评估磁分离后的细胞富集。

5. 在黑暗中4°C下孵育细胞悬浮抗体混合物15分钟。
6. 在20°C下，在370 x g下再次向管中加入3 mL的HBSS 2%FCS，然后再次离心。
7. 丢弃上清液，在 250 μL 链球蛋白耦合珠中重新悬浮颗粒（表 1，混合 2）。
8. 在冰上孵育细胞混合物和珠子20分钟。
9. 接下来，加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，在 370 x g 下再次混合，在 20°C 下再离心 3 分钟。
10. 在 2 mL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。

5. CD3-正细胞的磁性分离

1. 将柱放在磁铁上，加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，使系统加湿。等待 5 分钟。
2. 接下来，将标记的单元格移入列中。
3. 细胞悬浮液通过柱后，用3 mL的HBSS 2%FCS清洗柱X3。
4. 然后，从磁铁上取下柱子，并将其放入 15 mL 收集管中。
5. 要洗至目标细胞，将 5 mL 的 HBSS 2% FCS 添加到柱中，然后用柱塞冲洗柱塞。
6. 重复洗脱步骤与另外 5 mL 的 HBSS 2% FCS。

6. 流量细胞测定对靶细胞富集的评价

1. 将500μL的洗脱细胞悬浮液转移到标有"富集T细胞"的FACS管中。将200μL的"非富集T细胞"悬浮液转移到第二个FACS。
2. 然后，在20°C下以370 x g将两个管离心7分钟。
3. 丢弃上清液，然后向两管中加入100 μL荧光抗体混合3（见表1）。
4. 在黑暗中4°C下孵育两个管子20分钟。
5. 接下来，在管中加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，并在 370 x g下在 20°C 下将其离心 3 分钟。
6. 丢弃上清液，然后将每根管重新悬浮在 250 μL 的 HBSS 2% FCS 中。
7. 现在，通过流动细胞测定法评估CD3阳性细胞富集率。

7. 数据分析

1. 打开"FlowJo"图标，在"所有样本"窗口中拖动每个管的文件。
2. 双击"富集 T 单元格"文件，显示 Y 轴上向前散点 （FSC-A） 和 Y 轴上的侧散射 （SSC-A） 显示的点图。
3. 点击"多边形"圈出淋巴细胞群。
4. 接下来，双击圆圈填充以创建新窗口。
5. 在 Y 轴上选择"FSC-W"，在 X 轴上选择"FSC-A"，然后圈出 FSA-W 负数。在"子人口标识"窗口中，将单元格群命名为"单个单元格"。
6. 双击圆圈填充以创建新窗口。在 Y 轴上选择"CD3"，然后圈出 CD3 阳性细胞。在"亚人口标识"窗口中命名您的单元格群"T 单元格"。
7. 重复"非富集T细胞"。
8. 要可视化单元格群，请单击"布局编辑器"，并将"T单元格"填充从"富集 T 单元格"和"非富集 T 单元格"文件拖到选项卡中。
9. 将显示表示 CD3+ 淋巴细胞的点图。CD3+ 细胞应只出现在 CD3+ 浓缩管的感兴趣人群中。
10. 要评估已排序单元格中 CD3+ 淋巴细胞的富集性，请单击"表编辑器"，然后将"富集 T 细胞"和"非富集 T 细胞"文件的"T 细胞"总体拖到表中。
11. 在"统计"菜单上，选择"淋巴细胞的频率"细胞以检查所有淋巴细胞中CD3+细胞的百分比，然后单击"创建表"。
12. 参数值将显示在新表中。对于"富集T细胞"，CD3+细胞的频率应在80%左右。