1. 设置

缓冲液和试剂

1. 不含钙或镁的无菌磷酸盐缓冲盐 （PBS）
2. 涂层缓冲液 - 无菌 PBS 或碳酸盐缓冲器
3. PBS 中测定稀释 - 10% 胎儿牛血清 （FBS）
4. 细胞培养介质-RPMI 1640，带10%FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺
5. 洗涤缓冲液 - 含有 0.05% Tween20 的 PBS
6. 双蒸馏水 （ddH₂O）
7. 检测基质- 100mg AEC（3-氨基-9-乙基-卡巴佐尔），在10mL DMF（N，N，二甲基甲酰胺）。

设备

8. 拉米纳尔流量罩
9. 加湿培养箱（设置在37°C，5%CO_2）
10. 自动 ELISPOT 阅读器或解剖显微镜

材料

11. 埃利SPOT板
12. 无菌和非无菌储液罐
13. 移管器和提示
14. 无菌血清学移液器
15. 无菌、锥形聚丙烯管
16. 两个挤压瓶，用于洗板

测定特异性试剂

17. 细胞- 原细胞或细胞系（这里，使用C57BL/6小鼠的血细胞）
18. 兴奋剂 - 线粒素或抗原（此处，使用磷脂 12-米精酸盐 13-醋酸酯 （PMA， 50 ng/mL） 和碘霉素 （1 μM）
19. 原发抗体-生物氨酸抗细胞因子检测抗体（在测定稀释剂中稀释至2微克/mL）
20. 二次抗体-链球菌-马萝卜过氧化物酶（SAv-HRP）

2. 程序

涂层

1. 保持无菌状态，在层流罩内，将纯化的抗细胞因子捕获抗体稀释至无菌涂层缓冲液中最终浓度为0.5-4.0 μg/mL。（注：对于IFN-α和IL-6使用5μg/mL）。
2. 将捕获抗体溶液 100 μL/孔转移到 ELISPOT 板。
3. 用板盖盖住板并密封，以防止蒸发。
4. 在4°C下孵育板过夜。

阻塞

5. 第二天，在层流罩中揭开 ELISPOT 板。快速将板倒置到无菌湿巾上，从每个孔中取出捕获抗体溶液。
6. 然后，在每个孔中加入200μL的细胞培养基。此步骤将阻止在测定期间进行非特定绑定。
7. 更换板盖，在 37°C 下孵育板 2 小时。

电镀和激活细胞

8. 在培养板时，在细胞培养基中制备含有50纳克/mL PMA和1μM碘霉素的2X线粒体溶液。
9. 然后，将目标细胞悬浮液制备到2 x 10⁶细胞/mL的库存浓度。
10. 孵育完成后，通过快速将板倒置到层流罩内的无菌湿巾上，从每个孔中取出细胞培养基。
11. 接下来，生成库存单元悬架溶液的 2 倍串行稀释。为此，首先将200 μL的制备蜂窝悬浮液添加到ELISPOT板顶行的井中。
12. 然后，在包含细胞库存溶液的行下方的板的下五行中添加 100 μL 的普通细胞培养基。
13. 之后，通过将细胞悬浮液的 100 μL 从顶行移入正下方的行，执行 2X 串行稀释。通过上下轻轻移液，确保正确混合，确保均匀分布电池。
14. 对其余四行重复此过程。
15. 仅保留第六行的区域性介质。它将作为实验控制。
16. 接下来，将制备的线粒体溶液的100μL添加到板的前五行的实验井中。在对照井和第六行中，添加100μL的细胞培养基，不含线粒体。
17. 在 37°C、5% CO₂的培养箱中更换板盖和孵育板 20-48 小时。（注：20-24小时通常足以检测IL-2和TNF-α，而48小时对于IL-4和IFN-*是最佳选择。

检测

原抗体

18. 制备生物仿当化抗细胞因子检测抗体，在测定稀释剂中浓度为2μg/mL。
19. 此时通过在 PBS 中混合 0.05% 补间-20 来制备 20-25 mL 的洗涤缓冲液。
20. 孵育完成后，解盖板，并迅速将其倒置在水槽上，以清除井中的所有液体。（注意：在此之后，板不再需要保持无菌）。
21. 然后，通过在每个孔中加入±200 μL洗涤缓冲液来洗板。通过快速反转和轻拂水槽上的盘子来排出这种液体。重复此过程，共进行五次处理。
22. 接下来，在每个井中加入100μL的稀释生物氨酸抗细胞因子检测抗体溶液。在室温下孵育2小时，室温下孵育，或在4°C下孵育。

二次抗体

23. 孵育完成后，通过反转和轻拂水槽上的板来排出检测抗体。
24. 与之前一样，用+200 μL洗涤缓冲液清洗板5次，每次洗涤之间排出液体。
25. 接下来，在每口井中加入100 μ0μL的稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶溶液（稀释到其预先确定的最佳浓度测定稀释剂中）。
26. 更换板盖，在室温下在37°C下孵育1.5-2小时。

衬 底

27. 孵育后，使用前不超过15分钟，根据制造商的说明首先激活AEC基板溶液。
28. 接下来，丢弃井内的物品，像以前那样用洗涤缓冲液洗板五次。
29. 然后，立即将100μL的制备AEC基板溶液加入每个井中。
30. 在室温下孵育板约10-20分钟，同时监测现场发育。
31. 用清水将盘子浸在水槽上，从而停止反应。
32. 将盘子放在纸巾上，让盘子在一夜之间晾干，或直到完全干燥。取出板下的塑料托盘有助于干燥。

3. 数据采集和分析

1. 干燥后，这些斑点已准备好使用自动板读取器计数。在这里，使用CTL免疫点读取器，但该协议可以适用于任何读取器。
2. 首先打开仪器，然后打开计算机。然后，打开 CTL 程序并单击"扫描计数"。
3. 推动"弹出"托盘从机器中伸出。然后，拆下塑料适配器，并在 ELISPOT 板和适配器上对齐行"A"。
4. 选择要保存的文件的文件名和位置，并将板加载到托盘上。
5. 然后，单击软件上的"加载"并关闭机器侧面的门。
6. 按"计数后开始"。确保保存文件，然后打开质量控制"QC"软件来分析数据并计算点数。

笔记：

1. 在初步实验中应确定细胞的最小数量。最佳点数为 +50/井。如果加载的单元格太多，将很难检测出不同的斑点。此外，细胞会重叠，可能不会在膜上形成单层，因此检测水平可能会降低。
2. 优化实验时，考虑目标蛋白的预期表达水平。表达式越低，每口井所需的单元格数就越多。
3. 与 ELISA 不同，最好用手洗盘子，而不是使用洗盘。ELISPOT板更细腻，应避免刺穿PVDF膜。
4. 在孵育期间，应限制板块的运动，因为它可能导致斑点弄脏。
5. 板应储存在黑暗中，因为暴露在直光下会导致斑点褪色。