视频: Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

细胞周期分析：使用CFSE染色和流细胞测定法评估刺激后CD4和CD8 T细胞增殖

Overview

资料来源：佩尔切特·蒂鲍特^1，2，3，穆尼尔·西尔万^1，2，3，苏菲·诺沃^4，雷切尔·戈卢布^1，2，3
¹淋巴病系，法国巴黎巴斯德研究所免疫学系
² INSERM U1223，巴黎，法国
³巴黎迪德罗大学，索邦巴黎城，大提琴巴斯德，巴黎，法国
⁴流式细胞测定，细胞学和生物标志物 UtechS，转化科学中心，巴斯德研究所，法国巴黎

细胞周期是一个普遍的生命过程。在细胞周期中，细胞经历几次修改，以分成两个子细胞。这种机制发生在生物体的整个生命中，以响应其需求。细胞分裂和胚胎发育从单细胞酶中产生完整的生物体。在成年期间，细胞周期是许多关键生物过程的核心，如组织修复。

细胞分裂机制是严格控制的事件，细胞在最终分裂前进行逐步修改。尚未处于循环中的细胞被描述为处于 Gap 0 （G₀）阶段。在此阶段，细胞被认为是静止的。当细胞开始循环时，四个不同的相位被识别：_{间隙1（G1），}合成（S），间隙2（G2）和米托西斯（M）。G₁相是细胞DNA合成所需资源的检查点。然后，S 相发生，DNA 复制开始，然后是_G2相间，另一个检查点控制细胞分裂所需的所有元素。最后，细胞进入米细胞，并分裂成两个子细胞。

细胞分裂是许多不同生物系统中信息丰富的参数。在免疫学领域，白细胞增殖分析可以说明免疫反应机制。其他调查领域也依赖于细胞周期分析。例如，对肿瘤发育过程中的细胞周期的分析提高了我们对癌症的理解。

许多荧光染料现在可用于跟踪细胞增殖。这些染料的化学和光谱特性不同。存在两种不同类别的染料：蛋白质染料通过形成共价键与蛋白质永久结合，膜染料通过强疏水性关联在细胞膜内均匀地穿插。通过流动细胞学对免疫细胞增殖进行体外和体内研究是这两类细胞跟踪染料（1，2）最常见的应用之一。

CFSE（卡博司氟辛琥珀基酯）是一种荧光染料，标志着分裂细胞。最初，所有细胞都接收相同数量的染料;将细胞均匀地分割他们收到的染料，在它们的两个子细胞之间。因此，细胞周期之后，细胞中的染料强度会逐渐降低。CFSE 染色之后是传统的多参数流式细胞测定法，这是一种高通量、基于荧光的技术，允许根据细胞的CFSE染色程度对细胞进行表型和功能表征（3）。

在下面的实验中，我们使用CFSE染色和流式细胞测定法，在CD3刺激后，评估CD4+和CD8+T细胞在体外增殖。

Procedure

1. 准备

开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底擦干。
准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液（HBSS）含有 2% 胎儿小牛血清（FCS）。

2. 解剖

使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
使用钳子，移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放入含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿中。

3. 免疫细胞隔离

将脾脏放在40μm细胞滤网上，放在同一个培养皿上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
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Results

在本实验中，我们跟踪了在体外培养中脾CD4和CD8+T细胞的增殖。 3天后，我们没有看到CD4+和CD8+T细胞有或没有刺激的强烈增殖。这在图 2的顶部面板上可以看到，其中 CSFE 的峰值没有降低。然而，5天后，我们开始看到两个种群的增殖，这从CSFE峰值的下降（底部面板，图2）中可见一斑。CFSE?...

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Application and Summary

增殖测定通常用于不同的领域，如免疫学，以确定细胞的活化程度。它也在肿瘤诊断中执行，以确定患者的肿瘤攻击性。CFSE 染色是跟踪免疫细胞种群随时间扩散的有用技术。其他方法允许细胞周期的表征。BrdU，CFSE的等价物只纳入分裂细胞中。最近的Fucci小鼠模型甚至允许检测细胞周期阶段，而无需额外的染色。

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References

Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).

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1. 准备

开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底擦干。
准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液（HBSS）含有 2% 胎儿小牛血清（FCS）。

2. 解剖

使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
使用钳子，移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放入含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿中。

3. 免疫细胞隔离

将脾脏放在40μm细胞滤网上，放在同一个培养皿上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
将颗粒重新悬浮在2 mL的醋酸钾中，以赖解红细胞。等待 2 分钟，然后用 HBSS 2% FCS 将音量补至 15 mL。
在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
使用锥蓝色染色测定对细胞进行计数，并使用适当的HBSS 2%FCS调整最终细胞浓度至10⁷细胞/mL。

4. CFSE 染色和 T 细胞刺激

在 4 管（15 mL 管，标记为 1 到 4）中分配 10⁷个分离的脾细胞/管
在每个管中加入 3 mL HBSS 2%FCS。
在每个管中加入1μL的CSFE（最终浓度-5μM）。
在 5% CO₂培养箱中37°C孵育管10分钟。
在管3和4中，加入12 mL的HBSS 2%FCS+抗CD3抗体，最终浓度为2.5微克/mL。使用抗CD3抗体刺激管3和4，观察对细胞周期的影响。
在管 1 和 2 中，可添加 12 mL 的 HBSS 2% FCS。管1和2中的细胞不会受到刺激。
在 370 x g 下将所有管在 10°C 下离心 7 分钟。丢弃上生物。
在 2 mL 的 HBSS 2%FCS 中重新悬浮颗粒。
将所得溶液转移到 6 孔板上的单独孔中。
在37°C，5%CO₂孵育细胞3天。

5. 细胞染色

第 3 天，在井 1 和 3 中加入 2 mL HBSS 2%FCS。
大力移液，并将样品转移到5mL FACS管中。
继续在37°C、5%CO₂下从2-4号井中孵育剩余的细胞。他们将在第5天进行分析，以研究刺激对细胞周期的长期影响。
在 370 x g 下将管在 10°C 下离心 7 分钟。丢弃上生物。
在每个管中加入100μL的抗体混合物（见表1）。

抗体	氟铬	稀释
CD3	太平洋蓝	1/100
CD4	BV786	1/1600
CD8	体育	1/400
Thy1.2	BV605	1/400

表 1：抗体混合组合物。四种抗体鸡尾酒制剂，使用浓缩抗体荧光结合剂和HBSS。

在黑暗中的冰上孵育管子20分钟。
加入 1 mL 的 HBSS 2%FCS，并在 370 x g 下在 10°C 下将管离心 7 分钟。
丢弃上清液，在 200 μL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
将重新悬浮的颗粒转移到新的、标有 FACS 的管中。
使用 FACS 评估 T 细胞增殖。
第5天，与6孔板剩余两口的细胞重复细胞染色过程。

6. 数据分析

打开"FlowJo"软件，将文件拖到"所有示例"窗口中。
双击第 3 天收集的未刺激单元格的文件，以显示 Y 轴上向前散射的点图，在 X 轴上显示侧散射。
点击"多边形"并创建门控策略来选择淋巴细胞，Thy1.2⁺ CD3⁺细胞，并区分CD4+和CD8+细胞（见图1）。

图 1：浇注策略。细胞首先根据其形态进行封闭（左图：FSC-A、SSC-A）。然后，对 T 细胞进行封闭（中间：CD3、Thy1.2），并在 CD4⁺ T 细胞（橙色）和 CD8⁺ T 细胞（蓝色）上进一步划分（右侧：CD4、CD8）。请点击此处查看此图的较大版本。

对其他文件重复这些步骤。
要确定分割和非分割单元格的频率，请首先通过单击"布局编辑器"来可视化单元格群。
将 CD4 T 单元和 CD8 T 单元从四个管中的每一个拖到"所有样本窗口"
将显示表示每个总体的图形。
使用直方图来可视化结果，并选择"CFSE"作为参数，以比较不同的管和不同的群体。
非分裂细胞保持较高的CFSE水平，而增殖细胞将CFSE的含量分解为分裂细胞
在非分割的细胞上创建一个门，并将其应用于所有管中。
在分割单元格上创建一个门，并将其应用于所有管中。
要检查分割 CD3+ 单元格的频率，请单击"表编辑器"。
将感兴趣的群体-将CD8T细胞和CD4T细胞分开——拖到"表"中。
在"统计"菜单上，选择"T单元格的频率"，然后单击"创建表"以显示新表中的频率。
单击"创建表"。要显示频率值，应出现在新表上。

跳至...

0:02

Concepts

2:33

Preparation of Materials and Dissection

3:30

CFSE Staining and T-Cell Stimulation

5:16

Cell Staining

7:08

Data Analysis

9:05

Results

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