1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
2. 消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底干燥。
3. 准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液 （HBSS） 含有 2% 胎儿小牛血清 （FCS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
2. 使用钳子移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
3. 使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放在含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿上。

3. 免疫细胞隔离

1. 将脾脏放在培养皿上的 40 μm 细胞滤网上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
2. 用 1 mL 的 HBSS 2% FCS 对柱塞和滤网进行冲毛，以恢复粘附细胞。
3. 将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
4. 用 5 毫升的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将液体转移到 15 mL 管中。
5. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
6. 在 2 mL 氯化钾移液器中重新悬浮颗粒，以重新悬浮颗粒并赖解红细胞。
7. 等待 2 分钟，并将 HBSS 2% FCS 添加到悬浮颗粒中，以获得高达 14 mL 的体积。
8. 在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，通过上下移液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
9. 使用锥蓝色染色测定对细胞进行计数，并使用适当的HBSS 2%FCS量将最终细胞浓度调整到10⁷细胞/mL。

4. 收养转让

1. 在 5 mL 收集管中传输 2 mL 的细胞悬浮液。
2. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上清液。
3. 将颗粒重新悬浮在 2 mL 的 PBS 中，并在 370 x g下离心管，在 10°C 下 7 分钟。
4. 在 200 μL 的 PBS 中丢弃上清液并重新悬浮颗粒。
5. 使用带29G针头的0.5 mL注射器将200μL的细胞悬浮液静脉注射到实验小鼠的逆轨血鼻孔中。
6. 作为对照，用200μL的磷酸盐缓冲盐水在同一血弦中注射第二只小鼠。

5. 细胞收获和染色

1. 收养转移四天后，对小鼠实施安乐死并切除脾脏。
2. 如第 3 节所述，收获 ssnocy 细胞。
3. 将每只小鼠的100 μL细胞悬浮液转移到两个FACS管中，标有"控制"和"转移"。
4. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上生子。
5. 在表1所列稀释液中准备含有四种抗体的混合物。

表1：抗体混合组合。使用浓缩抗体荧光结合剂和HBSS制备四种抗体鸡尾酒。

6. 将100μL的混合加入到每个管子中，然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。
7. 加入 1 mL 的 HBSS 2%FCS，然后在 370 x g 下在 10°C 下将管离心 3 分钟。
8. 丢弃上生子，在 200 μL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
9. 将重新悬浮的细胞转移到新的、标有 FACS 的管中。
10. 使用流细胞测定法（如FACS协议所示）评估CD45.2阳性淋巴细胞的存在。

6. 数据分析

1. 打开"FlowJo"软件，在"所有样本"窗口中拖动每个管的文件。
2. 双击"传输"文件，在 Y 轴上显示正向散射"SSC-A"的点图上显示从该样本记录的单元格，在 X 轴上显示侧散射"FSC-A"。
3. 点击"多边形"并创建一个门控策略来选择淋巴细胞，然后使用细胞表面标记（CD45.1，CD45.2）区分供体和宿主细胞，然后表征CD45.2⁺细胞群（CD3，CD4）。
4. 使用"控制鼠标"文件重复分析步骤。
5. 要可视化单元格填充，请单击"布局编辑器"。
6. 将"转移的单元格"和"转移的CD4 单元格"从"传输"和"控制"文件拖到"布局编辑器选项卡"中。
7. 将显示表示 CD45.2⁺细胞和 CD4 淋巴细胞的点图。
8. CD45.2 传输的细胞应只出现在"转移鼠标"点图中。