这项工作是由美国康奈尔大学农业试验站（CUAES）NYC - 125433哈奇格兰特和康奈尔大学的支持，启动拨款，批到OKV

第1部分。制备固体培养基上生长的植物。 我们通常集中Murasige和Skoog（MS）培养基上的文化植物辅以1％蔗糖和0.7％的琼脂。它包含了所有必要的成分，保持健康的植物。 准备介质pH值5.7的MS，1L <ol><li>在1.5 - 2.0L高压灭菌瓶，加入到800毫升的水的MS粉2.15克。 </li><li>放置一个搅拌棒装入瓶中，并解散MS粉搅拌，搅拌板介质。 </li><li>边搅拌，加，一滴一滴，1N氢氧化钾MS培养基的pH值调整到5.7。 </li><li>添加10克的蔗糖，不断搅拌。 </li><li>添加7克，琼脂* </li><li>调整的准备介质的最终体积1000毫升，并通过高压灭菌消毒.* </li><li>广场蒸压中等搅拌板，边搅拌冷却下来，因此，琼脂不会沉淀在瓶底。降温介质〜60 ° C。 </li><li>倒入100毫米的Petri板。 &#39;保持在4板° C。 </li></ol> *提示1：不要试图解散琼脂。它会溶解在高压灭菌。 *提示2：保持在高压灭菌过程中瓶中的搅拌棒，​​你会用到它。 *提示3：如果你能保持你的手10秒的灭菌瓶，这意味着中期有足够的冷却下来，你就可以开始浇筑板。 第2部分。植物材料和生长条件。 <ol><li>消毒拟南芥的种子<ol><li>的Eppendorf离心管放入种子100毫克，加1毫升70％的乙醇。充分混匀，孵育2分钟。自旋种子，吸出上清液。 </li><li>添加1.8％的漂白粉溶液1毫升含0.1％Tween - 20的。混合10分钟。离心种子和吸出的漂白粉溶液。 </li><li>这一步要在层流罩。添加1毫升无菌水的种子，拌匀。离心种子，吸​​水。重复此步骤5次。 </li></ol></li><li>传播到在步骤1片（100粒种子/盘）准备的种子。 </li><li>种子板块保持在4 ° 24 - C在暗分层。 </li><li>种植植物在生长室为14天8小时light/16 h黑暗光照（250μmol米-2 s - 1时光合作用光子通量密度）和75％，23 / 19 ° C光/暗温度政权的相对湿度。 </li></ol> *提示1：漂白溶液稀释一个家喻户晓的Clorox公司，含有6％次氯酸钠和Tween - 20的加入终浓度为0.1％。 第3部分。 拟南芥原生质体的分离。 <ol><li> 14日龄的幼苗在15毫升过滤灭菌电视线解决方案的新鲜刀片切片2克。一次性无菌培养皿中，我们砍的植物材料。 </li><li>切碎组织转移到200毫升烧杯中，加20毫升过滤灭菌的酶液，摇动烧杯，让组织与酶液混合，用封口膜，铝箔盖。 </li><li>摇植物组织，在黑暗中在35 RPM，在室温为16-18小时</li><li>通过8层纱布，在W5的解决方案预湿筛，收集到50毫升猎鹰管释放的原生质体。 </li><li>筛原生质体经水洗布​​W5的解决方案与15毫升的奶酪布更多的时间。 </li><li>小心覆盖W5的解决方案与10毫升的原生质体，不干扰糖梯度;离心7分钟100克。 </li><li>收集在10毫升原生质体的酶液和W5解决方案（图1B）接口，并转移到一个新的50毫升猎鹰管。 </li><li>添加15毫升W5的解决方案，离心5分钟，在60克去除上清。 </li><li>在60克resuspending15毫升的W5的解决方案，离心机原生质体原生质体酶液洗5min后</li><li>取出上清，悬浮颗粒的原生质体在13毫升W5的解决方案。 </li><li>评估与血球计数细胞原生质体的产量。 </li></ol>第4部分。试剂： 电视线：0.3 M山梨醇; 50毫米氯化钙2过滤消毒，并保存在-20 ° C 。 酶溶液：0.5 M的蔗糖，MES - ​​KOH pH值5.7，20毫米10毫米氯化钙 ，氯化钾40毫米，1％的纤维素酶（Onozuka R - 10），1％Macerozyme（R10） 。过滤，消毒和新鲜使用。 W5的解决方案：0.1％（W / V）葡萄糖，0.08％（W / V）的氯化钾，0.9％（W / V）氯化钠，1.84％（W / V），2毫米的MES KOH pH值5.7 氯化钙 。过滤，消毒和存放在室温下。 第5部分：代表性的成果： 拟南芥文化1和第2部分中所描述的条件，呈现健康苗，适合于分离原生质体（图1A）。原生质体纯化蔗糖密度梯度耳鼻喉科离心和W5和酶的解决方案（图1B）接口收集。使用第3部分中所描述的原生质体分离过程中，我们通常的收获从一克新鲜苗 5-10完整的原生质体10 6（图1C）。 <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。拟南芥原生质体的分离 。 ，14日龄拟南芥幼苗组织收集，并转换为原生质体修改的过程（陈和Halkier，2000年），B，原生质体纯化蔗糖密度梯度离心法和酶液界面收集和W5的uffer（ 白色箭头 ），C，原生质体的明场显微镜。显微收集使用冷却CCD相机与蔡司Axioscope 2加显​​微镜接口。

<ol>
	<li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles.">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li><li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus.">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li><li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts.">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li><li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li><li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts.">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li></ol>

与康奈尔大学的科技企业和商业化中心（CCTEC），2008年6月已提交临时专利，其在植物基因功能分析的使用说明此过程。文案没有50341/015001：Vatamaniuk，确定，和翟，Z快速的植物基因功能分析的方法。

为了确保完整的原生质体的产量高，它是非常重要的启动与健康的植物。使用过滤消毒隔离原生质体解决方案。记住，原生质体是脆弱的。因此，当你正在处理的原生质体时，不要混用，吸管或涡他们大力，因为这将制动他们。相反，混合，通过缓慢旋转或胶带的离心管中的原生质体。所描述的过程产量完整的原生质体是可行的至少96小时。因此，原生质体，可用于研究各种细胞过程，如蛋白质?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5524</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1296</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri Dishes (100x15mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kreckeler Scientific</td>
<td>82-4001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase (Onozuka R&#x2010;10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI Corp</td>
<td>C32200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme (R10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI Corp</td>
<td>M22010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cheesecloth wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>06-665-29</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>1167152Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Allegra X&#x2010;15R Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>392932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop2 Plus Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of arabidopsis thaliana

原生质体是植物细胞有细胞壁酶去除的。超过40年前首次报道从不同植物组织的原生质体的分离<sup&gt; 1</sup&gt;，并一直适应研究各种细胞过程，如蛋白质的亚细胞定位，完整的细胞器的隔离和有针对性的双链RNA干扰（RNAi）基因失活，<sup&gt; 2-5</sup&gt;。原生质体分离协议大多采用成熟的拟南芥叶组织（例如35天的老厂）<sup&gt; 2-4</sup&gt;。我们采用14日龄的拟南芥幼苗修改现有的协议。在此过程中，一克14日龄的幼苗产生5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt;原生质体至少96小时保持不变。从幼苗原生质体的产量是准备成熟的拟南芥叶相媲美，但原生质体的分离，而不是35-36天，在15天完成。这使得减少的时间和需要隔离时，使用成熟的植物原生质体的生长室空间，并加快下游研究，需要完整的原生质体。

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Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

这个视频展示了从14日龄拟南芥幼苗组织中分离完整的原生质体的过程。此过程加快，原生质体保持不变的至少96小时，是从，而不是一月龄成熟的植物幼苗孤立的，需要完整的原生质体的检测。

从14日龄的幼苗组织原生质体的分离拟南芥</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

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Biology

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

35.7K 次观看.  Cornell University. 这个视频展示了从14日龄拟南芥幼苗组织中分离完整的原生质体的过程。此过程加快，原生质体保持不变的至少96小时，是从，而不是一月龄成熟的植物幼苗孤立的，需要完整的原生质体的检测。