我们感谢她的手稿上的有价值的见解博士帕特里夏Manosalva。经费是由美国国家科学基金会植物基因组计划，获奖数量DBI - 0605059。

第1部分：植物材料 本生烟沉默使用的植物应约2个半周龄时，子叶和第2 - 4片真叶出现。番茄（ 白毛lycopersicum）植物7 - 8天的出现，片真叶时尚未出现。 第2部分：VIGS 第1天<ol><li>对于每一个实验中，农杆菌窝藏pTRV1，pTRV2，pTRV2 PDS和pTRV2主机靶基因是生长在LB琼脂板与卡那霉素50微克/毫升和100微克/毫升利福平补充。卡那霉素的选择，而利福平这样做的农杆菌pTRV质粒。 2天，在30 ° C孵育板。 PDS的沉默会导致植物的光漂白和作为一个沉默的效率控制使用。此外，必须克隆到一个pTRV2载体的基因被下调。有网关兼容pTRV2可能有助于克隆的载体，是由刘等人的描述。 （2002年）。 </li></ol>第3天<ol><li>接种2 - 3毫升与上述每一株抗生素的LB液体培养。晃动在30 ° C孵育16 - 18小时和200 RPM </li></ol>第4天<ol><li>接种1：到次要的液体诱导培养基（IM），与卡那霉素，利福平和200微米的乙酰丁香酮（表1，2和3）IM文化，小学文化25稀释。乙酰丁香酮是用来作为一种必需的，而在IM模拟的环境，这种病菌遇到主机质外体的T - DNA 转移 到植物9农杆菌vir区基因的诱导。孵育，在30 ° C震动20 - 24小时和200 RPM </li></ol>第5天<ol><li>收获的细胞，离心10分钟，3000 × G.悬浮在相同体积与10毫米MgCl 2的 10毫米MES的pH值5.5，原有的文化。细胞可能是轻轻振荡，以重悬。 </li><li>再次为10分钟3000 × G. Centrifugue细胞重悬在半原始文化的音量氯化镁10毫米，10毫米的MES pH值5.5。 </li><li>每个细菌培养一种细菌悬浮液，准备与外径为 0.3 600。添加乙酰丁香酮的终浓度为400微米pTRV1文化。 </li><li>包含pTRV1 pTRV2在1比1的比例（或含有目的基因的pTRV2）混合的文化。还包括一个pTRV2 - PDS控制。请注意，最后的乙酰丁香酮的浓度是现在的200微米，每一种文化是一个外径600 0.15。 </li><li>标签要保持沉默的基因和实验日期渗透苗。 </li><li>到每个渗入叶用针戳一个孔。使用1毫升不必要的注射器，渗透到幼苗的菌悬液。番茄，渗透子叶同时为N。 benthamiana，最大的两个片真叶渗透。五毫升每个细菌混合，应足以渗透到15 N 。 benthamiana和25个番茄幼苗。改变，不浇水，直到接种后的第二天植物之间的渗透和手套，以避免交叉污染。 </li><li>植物都保持在20 - 22 ° C的增长与一个每天16小时的长度和50％RH至少3个半星期之前，他们可能会使用检测室。 </li></ol>第3部分：代表结果图1显示了一个代表性的实验与 N benthamiana和番茄植株适用于PDS沉默。植物漂白表型特征，观察植物的减少数量的类胡萝卜素。对于PDS沉默的对照植株，漂白开始被看作是尽快为1 ½周后渗透。 <img src="/files/ftp_upload/1292/Figure 1A 1292.jpg" alt="图1a" /><img src="/files/ftp_upload/1292/Figure 1B 1292.jpg" alt="图1b" /> 图1。PDS控制基因沉默的原因在本生烟（A）和番茄（二）植物漂白。照片是3个半星期后的沉默。 表1。诱导培养基（IM）的制备。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 400毫升</td><td>蒸馏水2 O </td></tr><tr><td> 4.88摹</td><td> MES（2 - （4啉）乙烷磺酸） </td></tr><tr><td> 2.5摹</td><td>血糖</td></tr><tr><td> 0.12摹</td><td>的NaH 2 PO 4 </td></tr></tbody></table>带上一个DH 2 O的最终体积475毫升，并调整pH值至5.6 。高压灭菌器。介质冷却下来后，添加25毫升20X AB盐。 表2。AB盐的制备。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 20克</td><td> NH 4 CL </td></tr><tr><td> 6摹</td><td>硫酸镁4 · 7H 2 O </td></tr><tr><td> 3摹</td><td>氯化钾</td></tr><tr><td> 0.2克</td><td> 氯化钙 </td></tr><tr><td> 0.05摹</td><td> FESO 4 · 7H 2 O </td></tr></tbody></table>带至终体积为1升蒸馏水。高压灭菌。要知道，AB盐作为一个橘黄色粉末沉淀。只要将它们混合以及通过其使用前旋转。 表3。乙酰丁香酮的制备的200毫米。请注意，乙酰丁香酮，应准备的一天，它将被用来。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 19.6毫克</td><td>乙酰丁香酮（3&#39;，5&#39; -二甲氧基-4&#39; - 羟基苯乙酮） </td></tr><tr><td> 500μL， </td><td> DMSO（二甲基亚砜） </td></tr></tbody></table>

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	<li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+as+a+plant+immune+system+against+viruses.">RNA silencing as a plant immune system against viruses.</a> Trends Genet. 17, 449-459 (2001).</li><li>Carrington, J. C., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+plant+and+animal+development.">Role of microRNAs in plant and animal development.</a> Science. 301, 336-338 (2003).</li><li>Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+as+a+translational+repressor+of+APETALA2+in+Arabidopsis+flower+development.">A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development.</a> Science. 303, 2022-2025 (2004).</li><li>Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leaf+morphogenesis+by+microRNAs.">Control of leaf morphogenesis by microRNAs.</a> Nature. 425, 257-263 (2003).</li><li>Brigneti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+pathogenicity+determinants+are+suppressors+of+transgene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana.">Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.</a> EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant Journal. 31, 777-786 (2002).</li><li>MacFarlane, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+tobraviruses.">Molecular biology of the tobraviruses.</a> J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).</li><li>Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+study+to+determine+the+extent+of+gene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana+and+other+Solanaceae+species+when+heterologous+gene+sequences+are+used+for+virus-induced+gene+silencing.">A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing.</a> New Phytol. 176, 782-791 (2007).</li><li>McCullen, C. A., Binns, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+and+plant+cell+interactions+and+activities+required+for+interkingdom+macromolecular+transfer.">Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).</li><li>Rosebrock, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+E3+ubiquitin+ligase+targets+a+host+protein+kinase+to+disrupt+plant+immunity.">A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity.</a> Nature. 448, 370-374 (2007).</li><li>Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+of+single+and+multiple+members+in+a+gene+family+of+rice.">RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice.</a> Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).</li><li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use,+tolerance+and+avoidance+of+amplified+RNA+silencing+by+plants.">Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants.</a> Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).</li><li>Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+MAPK+cascades,+NPR1,+and+TGA+transcription+factors+play+a+role+in+Pto-mediated+disease+resistance+in+tomato.">Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato.</a> Plant J. 36, 905-917 (2003).</li><li>Liu, E., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cDNA+libraries+for+virus-induced+gene+silencing+(VIGS)+using+tobacco+rattle+virus.">Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus.</a> Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).</li></ol>

病毒诱导的基因沉默是一种方法，允许快速反向遗传筛选。它避免了新一代的T - DNA或转座子介导的基因敲除，这是只有在某些植物如拟南芥和玉米。它也避开了厂房改造耗时的过程，并允许针对多个基因在同一时间，只要他们有足够的同源性10或不同的主机上的靶序列，同时安排在沉默载体6，11 。 然而，沉默是没有100％有效，因此，必须小心解释结果...

virus-induced gene silencing (vigs) in nicotiana benthamiana and tomato

RNA干扰（RNAi）是一个非常具体的的由双链RNA 1引发的基因沉默的现象。这沉默机制使用RNA的监管的两大类：小分子RNA，这是从非蛋白质编码基因和短干扰RNAs（siRNAs）。植物利用RNAi技术来控制转座子和发挥对发育过程中，如花器官的形成和叶的发展 2,3,4的严格控制。植物也利用RNA干扰抵御感染病毒本身。因此，许多病毒已经进化的基因抑制基因沉默，让他们成功定植其主机5。 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种方法，它利用植物RNAi介导的抗病毒防御机制。在未修改病毒感染的植物的机制是专门针对病毒的基因组。然而，与病毒载体携带来自宿主基因的序列，这个过程可以额外针对相应的主机的mRNA。 VIGS已适应高通量功能基因组学在植物使用的植物病原农杆菌提供，通过其Ti质粒，重组病毒携带整个或部分沉默针对性的基因序列。全身病毒的传播和内源性植物RNAi的机械，其余的照顾。相应的靶基因的dsRNAs生产，然后到21至24个核苷酸的siRNA的核糖核酸酶Dicer的切割。这些siRNAs最终指导的RNA诱导的沉默复合体（RISC）降解目标成绩单2。 在VIGS已采用不同载体和最常用的是基于对烟草脆裂病毒（TRV）。 TRV是一个双边的病毒，正因为如此，两个不同的答农杆菌株用于VIGS。其中一个进行pTRV1，而另一方面，pTRV2，港口的外壳蛋白和用于VIGS 6,7序列编码的病毒复制和运动功能。接种benthamiana烟草和番茄幼苗混合两种菌株在基因沉默的结果。内源性的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的基因，这将导致漂白，沉默是用来作为VIGS的效率控制。但是，应该指出，在番茄的沉默通常小于 N中的有效benthamiana。应始终感兴趣的基因的RNA转录本丰度测量，以确保有效地被下调的靶基因。然而，从北外源基因序列benthamiana可以用他们各自的同源基因沉默番茄，反之亦然8。

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Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

病毒诱导的基因沉默（VIGS）的基因表达击倒在方法的说明<em&gt;烟草benthamiana</em&gt;和西红柿。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）烟草benthamiana和番茄

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

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