作者感谢提供优秀的技术协助pHPL和Margaretha Frühwirth和丹妮拉泰勒博士卡塔琳娜Schallmoser。

A）ECFC ISOLATON 第一天： <ol><li>之前，请先准备实验的细胞培养液中血管内皮生长培养基- 2（EGM - 2）。补充500毫升内皮细胞基础培养基与肝素（000 U / ml的1毫升）2，青霉素/链霉素100X 5ml的解决方案（所有Sigma公司，圣路易斯，密苏里州; <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ），L -谷氨酰胺（终浓度为2毫米），并汇集人类血小板裂解液（pHPL）50毫升。然后添加2毫升hFGF - B的，氢化可的松0.2毫升，0.5毫升血管内皮生长因子，0.5毫升表皮生长因子，IGF - 1和0.5毫升的抗坏血酸（如SingleQuots提供0.5毫升，所有龙沙，Walkersville，MD <a href="http://www.lonzabioscience.com/">; http://www.lonzabioscience</a> 。 <a href="http://www.lonzabioscience.com/">COM /</a> ）。无菌滤液通过一个0.2米孔径大小500毫升Millipore公司真空过滤介质。由于pHPL形成小血块，您可能需要一个中型的两个过滤器。预温过滤临时股东大会，2至37 ° C水浴中</li><li>收集到一个6毫升不含防腐剂钠肝素血液真空采血管管从肘静脉成人外周血5毫升的血液样本。最大的两个小时内，你应该处理的血液样本。 </li><li>开始准备一个75厘米的2（T75;中光学）一个通风帽，一个25毫升吸管和两个5毫升移液器在层流台的容量瓶中。 </li><li>预填充15毫升预热补充到烧瓶中，用25毫升吸管EGM - 2。现在打开血小瓶样品所有5毫升5毫升吸管入烧瓶。空血小瓶5毫升额外EGM - 2的第二个5毫升吸管冲洗。 T75内的总体积为25毫升。关闭通风帽的容量瓶中，并在孵化器的地方，在37℃，5％CO 2和95％湿度为24小时。 </li></ol>第2天： <ol><li>经过约24小时（过夜），你应该删除中期血的混合物，除去非贴壁细胞。对于这个准备两个25毫升移液管和层流三个5毫升移液器，预温20毫升至37 ° C水浴中补充EGM - 2）和（前一天准备30毫升PBS。 </li><li>从培养箱取出样品的容量瓶中，并删除所有与25毫升吸管的上清液。小心不要划伤烧瓶的表面，避免损坏任何潜在的殖民地。内瓶细胞黏附表面洗净，轻轻地从一个侧面添加10毫升预热PBS和倾斜烧瓶其他三次。取出PBS立即每次和丢弃。 </li><li>添加20毫升的新鲜预热EGM - 2的烧瓶中，放入孵化器。这个过程应该是尽可能快，尽可能温柔的贴壁细胞不分离。 ECFCs分离容易，如果他们是在PBS或在室温下保持长期。 </li><li>通过烧瓶屏幕系统每隔一天一天两起使用低倍率轻显微镜寻找ECFC产物。当一个殖民地被发现在上面标记的指示殖民地的地位瓶的外侧。注意的flaks不应超过5分钟外的孵化器。 </li></ol>第5天： <ol><li>在播种后第五天执行一个完整的介质变化，除去非贴壁细胞。为此预温20毫升EGM - 2至37 ° C水浴中，并准备两个25毫升移液器。 </li><li>用25毫升吸管取出完全培养基，并添加新鲜，预热补充EGM - 2尽快。细胞不应该没有超过一分钟，以避免干燥介质。进入孵化器的地方回来，每天重复筛查烧瓶。 </li><li>饲料中的细胞更换新鲜补充EGM - 2每周两次30％的中等。 </li></ol>日14-28： <ol><li>鹅卵石形态的典型菌落出现12天左右。马克烧瓶上方的外侧，表明每个殖民地的位置。允许的殖民地，直到第28天增长，除非单细胞开始分离。有一次，小学殖民地已经确定，他们可以收获14和28天之间，这取决于它们的大小。 </li></ol> B.）ECFC收获<ol><li>预温5毫升胰蛋白酶0.05％/ EDTA，20毫升PBS和5毫升新鲜补充EGM - 2。 </li><li>彻底清除介质从烧瓶成猎鹰管（小心不要触摸表面的容量瓶中，以避免损坏任何潜在的殖民地），仔细用10 ml预热的PBS洗细胞。 </li><li>在孵化器5分钟，加入5毫升胰蛋白酶/ EDTA和孵化。细胞不应超过7分钟的暴露，就变成有毒的胰蛋白酶，因为。彻底攻烧瓶双方，有利于细胞分离。淬火加入约10毫升的保留使用的培养基的胰蛋白酶蛋白酶活性。 </li><li>删除到50毫升法尔科的细胞悬液n管。洗烧瓶曾经用10 ml PBS，这是以后添加到收获的细胞悬液。离心细胞悬液300克7日在4分钟° C至收集细胞并去除胰蛋白酶。弃上清，并立即在1毫升PBS重悬细胞沉淀。置于冰上。 </li><li>确定细胞数量在朱庇特的协议，由R.李嘉图和K. Phelani 5。 </li></ol> C）ECFC扩展<ol><li>补充500毫升EGM - 2在1.1中所述）。预温至37℃，水浴。 </li><li>对于约2500平方厘米的文化空间，准备一个为11 T220（225 厘米2）或15 T175（175 厘米 2）或一个四层次的细胞工厂（CF - 4; NUNC，Naperville的，IL <a href="http://www.nuncbrand.com/">;</a> http://www.nuncbrand <a href="http://www.nuncbrand.com/">COM</a> ）。此外，您将需要两个新鲜通风帽和一个特殊的无菌层流台漏斗。 </li><li>要在起始细胞密度为100种子ECFCs C /厘米2的细胞数的计算是必要的。对于一个CF - 4 252800细胞悬浮在500毫升的新鲜EGM - 2，浇成的CF - 4使用无菌漏斗。关闭排气第一个发泄的CF - 4一个经度一侧倾斜，使媒介之间的所有4个面粉的平等分配。然后倾斜室和开放式排气帽盖。放置在孵化器CF - 4。 </li><li>变化中至少每周一次，直到CF - 4的20％是融合。 </li><li>收获细胞中所述B）使用70毫升的胰蛋白酶/ EDTA，约200毫升PBS。 </li></ol>代表性的成果使用这种隔离方法，我们观察到在12天的主要的集落形成。在先前的研究能够收回平均为4.0 ± 0.8每毫升外周血所得的ECFC 殖民地 4 ECFCs显示一个典型的鹅卵石外观。大规模扩张后，用了100个细胞/平方厘米的播种密度中，我们获得了一个由3男1女志愿者（年龄26至50岁之间）约30天的总&gt; 1 × 10 8个细胞。 在这些条件下培养ECFC增生，功能和基因组稳定4此外细胞可以储存在进一步利用液氮（10％DMSO）3,4

<ol>
	<li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia.">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li><li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum.">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

这种新颖的隔离和扩展方法是一种简单而有效的过程，更有效率和更短的时间消耗，避免任何细胞分离（不需要密度梯度），比传统技术更便宜。通过使用pHPL接触到牛抗原和公认的后续xenoimmunization被排除在外。文化期间可形成小血块，pHPL造成。根据我们的经验，这些凝块不影响细胞集落形成和细胞增殖或功能。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Endothelial basal Medium-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EGM-2 SingleQuots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid</td>
</tr>
<tr>
<td>preservative-free Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom AG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10U/ml per EGM-2</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2mM per EGM-2</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin and Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100U/mL Penicillin and 100&mu;g/mL Streptomycin per EGM-2</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin/1mM EDTA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Cell Culture, Invitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>7ml for T75 flask 70ml for CF-4</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Four-layered cell factory (CF-4) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Funnel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75cm2 culture flask (with vented cap)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin</td>
</tr>
<tr>
<td>50ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Stripetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25ml Stripetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Squeezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0,2 pore size sterile filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2x 500ml per EGM-2</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells

本文介绍了一个新颖的恢复策略，对内皮细胞集落形成祖细胞肝素（ECFCs），但在其他unmanipulated成人外周血内，平均12天。 &gt; 1 × 10 8 ECFCs大规模扩张后可以得到进一步的测试。有利的是，通过使用pHPL人体细胞与牛血清抗原的接触可以被排除在外。通过流式细胞仪和免疫组化分离的细胞可以被定性为ECFC 和他们在体外的功能，形成像血管结构，可在基质胶实验测试。这些细胞可皮下注射的小鼠模型，以形成功能， 在体内血管灌注。经过长期的扩张和冷冻保存扩散，功能和基因组的稳定性出现3,4予以保留。 这种动物蛋白的隔离和扩展方法是很容易适用于生成大量的ECFCs。

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Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

内皮细胞集落形成祖细胞（ECFCs）是一种很有前途的的工具来研究血管稳态和维修。<sup&gt; 1,2</sup本文介绍了一种新的动物血清，肝素成人外周血汇集人类血小板裂解液抗牛免疫的风险递减（pHPL）隔离和扩展ECFC方法。

成人内皮细胞集落形成祖细胞的分离和大型规模扩张

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

isolation-large-scale-expansion-adult-human-endothelial-colony

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 次观看.  Medical University of Graz, Austria. 内皮细胞集落形成祖细胞（ECFCs）是一种很有前途的的工具来研究血管稳态和维修。 1,2