资金来源：康涅狄格州大学研究基金会和分子和细胞生物学系到SVN，西格玛郗赠款援助的研究和安东尼H.和Majorie R. 普罗迪研究生教育奖学金，以AJC

<ol><li>准备500 0.22微米的过滤器消毒的人工海水MLS（FSW;盐度35个百分点）。 0.22微米微米的过滤器过滤器通过人工或自然海水去除微粒和细菌。 </li><li>麻醉放置在2％的乙醇解决方案，在FSW一个成年人夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes） 。约10分钟，放置在麻醉的动物。鱿鱼将停止游泳，并不会积极响应触摸。持续呼吸，表明地幔的运动，和色素细胞活动仍然应该遵守。 </li><li>面临的一个标准蜡剥离托盘腹朝上放置的鱿鱼。 FSW含有2％的乙醇浸泡动物。 </li><li>使用一个标准的200μL枪头，拉回来漏斗和地幔位于两只眼睛之间的主要头侧血管暴露。 </li><li> 26.5号针头，穿刺头侧血管，并撤回在50-100微升血淋巴使用无菌1 mL注射器。在无菌的1.5 mL试管放置在冰血淋巴。 注：如果动物将作为捐助者多次，只有在任何时候撤回10-20微升血淋巴。动物返回正常海水的水箱。动物将恢复在30分钟内。 </li><li>新鲜采集的血细胞洗涤和鱿鱼林格的解决方案（S -林格; 530毫米氯化钠，氯化钾10毫米，25毫米MgCl 2的，10毫米氯化钙 2和10毫米的HEPES缓冲，pH值7.5）在500μL重悬。 </li><li>血细胞的浓度是由血球，以及约2,000个单元格添加到腔玻璃盖玻片，并允许在室温下10分钟，坚持玻璃。在这个密度，血细胞载玻片表面上形成一个统一的单层。 </li><li>为了观察细菌绑定到主机上的血细胞，血细胞接触到荧光标记的菌株，如弧菌鲵 ES114和/或哈维氏弧菌 B392，每片含绿色荧光记者。 五 。 ES114和五鲵哈维 B392成长日志中期阶段在海水蛋白胨媒体（SWT）在28 °的轨道摇床中的C。分光光度计在600nm处的光密度测量，以确定细胞密度。细菌颗粒离心5分钟（5,000 RPM），丢弃上清液，沉淀是在S -林格重悬。 </li><li> 10万个细菌细胞被添加到每个分庭，以便有50％的平均血细胞细菌。血细胞/细菌混合物孵育中的S -林格的解决方案在25 ° C为1小时，时间确定产生约束力的最高水平。 </li><li>血细胞的细胞质中，然后荧光染色与0.005％CellTracker橙（Invitrogen公司），然后在S -林格洗净，以可视化的细胞。 </li><li>被视为相关的细菌染色的血细胞荧光使用蔡司发现V20荧光立体或徕卡SP2光谱激光共聚焦显微镜，并在整个动物细胞表面列举。 </li></ol>代表性的成果由于头足类动物血淋巴中含有外血蓝蛋白，而不是后氧合血红蛋白，血淋巴中会变成深蓝色。 〜5000μL的血淋巴血细胞的平均使用这种方法获得。坚持腔盖玻片，荧光染色后，血细胞应该会出现明亮的荧光红色和形状的变形虫。对于细菌粘附， 五鲵将坚持不佳的血细胞（血细胞每1-2细菌细胞），而五哈维将坚持强（10-15％血细胞细菌细胞）。 <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。成人夏威夷短尾鱿鱼Euprymna scolopes显示头侧血管的位置。 <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="图2" /> 图2：血细胞暴露于弧菌鲵（A） 和哈维氏弧菌（二）的结果。红，细胞跟踪橙，绿，GFP标记的细菌。

<ol>
	<li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis.">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li><li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unseen+forces:+the+influence+of+bacteria+on+animal+development.">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li><li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism.">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li><li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes.">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li><li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+animal-bacterial+association:+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment.">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes:+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri.">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li><li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+fischeri+and+its+host:+it+takes+two+to+tango.">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li></ol>

有关免疫系统的作用，在调解有益的细菌和主机之间的分子信号研究，近年来，我们与他们的菌群真核生物的共同进化理解作出了重大贡献。鱿鱼/弧菌系统本身已经证明了作为一个听话的模型系统回答在这一领域的根本性问题2,3,5,6,8。鱿鱼Euprymna scolopes光器官允许殖民统治完全由发光弧菌鲵 。由于房子的组织，保持与海水接触的细菌，鱿鱼，必须不仅促进具体的共生还要继?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
<td>155411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>26.5 G 1ml latex-free insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton, Dickinson and Company</td>
<td>C34551</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Tracker Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34551</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SteREO Discovery V20 Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SP2 Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

obtaining hemocytes from the hawaiian bobtail squid euprymna scolopes and observing their adherence to symbiotic and non-symbiotic bacteria

有关免疫系统的作用，在调解有益的细菌和主机之间的分子信号研究，近年来，我们与他们的菌群真核生物的共同进化理解作出了重大贡献。夏威夷短尾鱿鱼之间的共生协会，<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;和发光细菌<em&gt;弧菌鲵</em&gt;已被利用作为一个模型系统了解动物发育有益细菌的影响。最近的研究表明，血细胞巨噬细胞样，唯一的鱿鱼主机的先天免疫系统的细胞成分，可能发挥了重要作用，在调解这个协会的建立和维护。该协议将展示如何获得血细胞从<em&gt; E。 scolopes</em然后用这些细胞的细菌结合实验。成人鱿鱼先麻醉前用注射器收集主要头侧血管血淋巴。主机的血细胞，提取的血淋巴中，坚持腔盖玻片，然后接触到绿色荧光蛋白标记的共生<em&gt;弧菌鲵</em&gt;和非共生<em&gt;哈维氏弧菌</em&gt;。血细胞用荧光染料（细胞跟踪橙色，Invitrogen公司），然后counterstained可视化使用荧光显微镜。

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Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

该视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼的血细胞（血细胞），<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;细胞生物和细菌粘附实验使用。血细胞将用荧光染料染色和GFP标记的细菌接触到。

获得血细胞从夏威夷短尾鱿鱼 Euprymna scolopes和观察他们坚持共生和非共生细菌

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

obtaining-hemocytes-from-hawaiian-bobtail-squid-euprymna-scolopes

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

13.1K 次观看.  University of Connecticut. 该视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼的血细胞（血细胞）， Euprymna scolopes细胞生物和细菌粘附实验使用。血细胞将用荧光染料染色和GFP标记的细菌接触到。