Finanzierungsquellen: University of Connecticut Research Foundation und dem Department of Molecular and Cell Biology an SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-Forschung und Antonio H. und R. Majorie Romano Graduate Education Fellowship zu AJC

<ol><li> Bereiten Sie 500 ml 0,22 um Filter-sterilisiert künstlichem Meerwasser (FSW; Salzgehalt 35 ppt). Filter künstlichen oder natürlichen Meerwasser durch ein 0,22 um-Mikron-Filter zur Entfernung von Partikeln und Bakterien. </li><li> Anesthetize einen Erwachsenen Hawaiian Bobtail Squid (Euprymna scolopes), indem Sie in eine 2% ige Lösung von Ethanol in FSW. Legen Sie das Tier in Narkose für etwa 10 Minuten. Der Tintenfisch wird aufhören Schwimmen und sich nicht aktiv auf Berührung reagieren. Fortsetzung Atmung, angegeben durch die Bewegung der Mantel und Chromatophor Aktivität sollte noch beachtet werden. </li><li> Legen Tintenfisch mit Bauchseite nach oben auf einem Standard-Wachs Dissektion Fach. Tauchen Sie das Tier mit FSW mit 2% Ethanol. </li><li> Mit einem Standard 200 ul Pipettenspitzen, ziehen Sie den Trichter und Mantel zu den wichtigsten cephalica Blutgefäß zwischen den beiden Augen entfernt aussetzen. </li><li> Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit 26,5-Gauge-Nadel, Punktion der V. cephalica Blutgefäß und ziehen zwischen 50-100 ul Hämolymphe. Legen Sie die Hämolymphe in ein steriles 1,5 ml-Röhrchen auf Eis. Hinweis: Wenn ein Tier als Spender mehrfach dienen soll, nur zurücktreten, 10-20 ul der Hämolymphe zu einem bestimmten Zeitpunkt. Zurück das Tier zu einem normalen Meerwasseraquarium. Das Tier wird innerhalb von 30 min wieder zu beleben. </li><li> Frisch gesammelte Blutzellen werden gewaschen und resuspendiert in 500 ul von Squid Ringer Lösung von (S-Ringers, 530 mm NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5). </li><li> Hemocyte Konzentrationen werden durch Zählkammer bestimmt, und etwa 2.000 Zellen werden chambered Glasdeckgläschen hinzugefügt, und man ließ sie auf das Glas für 10 min bei Raumtemperatur zu halten. Bei dieser Dichte, bilden die Blutzellen eines einheitlichen Monolage auf dem Glas Gleitfläche. </li><li> Zur Beobachtung bakterielle Bindung an Host Blutzellen sind Blutzellen zu einer fluoreszenzmarkierten Bakterienstamm wie Vibrio fischeri ES114 und / oder Vibrio harveyi B392, die jeweils eine grün fluoreszierende Reporter ausgesetzt. V. fischeri ES114 und V. harveyi B392 sind bis Mitte der log-Phase in einem Meerwasser-Trypton Medien (SWT) bei 28 ° C in einem Schüttler gewachsen. Die optische Dichte bei 600nm spektrophotometrisch die Zelldichte zu bestimmen. Die Bakterien werden durch Zentrifugation (5.000 rpm für 5 min), der Überstand verworfen und das Pellet wird in S-Ringers resuspendiert. </li><li> 100.000 Bakterienzellen werden mit jeder Kammer hinzugefügt gut so, dass gibt es 50 Bakterien pro hemocyte im Durchschnitt. Die hemocyte / Bakterien Mischungen werden in S-Ringer s-Lösung bei 25 ° C für 1 h, eine Zeit bestimmt, um die maximale Höhe der Bindungsausbeute inkubiert. </li><li> Das Zytoplasma der Blutzellen werden dann fluoreszierend mit 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) gefärbt und anschließend gewaschen in S-Ringers, um die Zellen zu visualisieren. </li><li> Stained Blutzellen mit assoziierten Bakterien werden durch Fluoreszenz betrachtet entweder mit einem Zeiss Entdeckung V20 fluoreszierenden Stereoskop oder eine Leica SP2 spektrale Laser konfokalen Mikroskop und zählte über die gesamte Oberfläche der tierischen Zelle. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Da Kopffüßer Hämolymphe enthält extrazellulären Hämocyanin und nicht Hämoglobin, auf Sauerstoffzufuhr wird die Hämolymphe wiederum dunkelblau. Ein Durchschnitt von ~ 5000 Haemocyten pro ul Hämolymphe wird man mit dieser Methode. Nach Einhaltung der Kammern Deckgläser und Fluoreszenzfärbung, sollte die Blutzellen erscheinen hell fluoreszierend rot und amöboide Form. Für bakterielle Adhäsion, V. fischeri wird schlecht haften, die Blutzellen (1-2 Bakterienzellen pro Blutkörperchen), während V. harveyi wird stark kleben (10-15 Bakterienzellen pro hemocyte). <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Adult Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes zeigt Lage der cephalica Blutgefäß. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Ergebnisse der hemocyte Exposition gegenüber Vibrio fischeri (A) und Vibrio harveyi (B). Red, Cell Tracker Orange; Green, GFP-markierten Bakterien.

<ol>
	<li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis.">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li><li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unseen+forces:+the+influence+of+bacteria+on+animal+development.">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li><li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism.">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li><li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes.">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li><li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+animal-bacterial+association:+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment.">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes:+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri.">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li><li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+fischeri+and+its+host:+it+takes+two+to+tango.">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li></ol>

Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Der squid / vibrio System hat sich als gefügig Modellsystem, um grundsätzliche Fragen in diesem Bereich 2,3,5,6,8 beantworten bewährt. Das Licht-Orgel des Tintenfisches Euprymna scolopes erlaubt Kolonisierung ausschließlich durch die leuch...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
<td>155411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>26.5 G 1ml latex-free insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton, Dickinson and Company</td>
<td>C34551</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Tracker Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34551</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SteREO Discovery V20 Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SP2 Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

obtaining hemocytes from the hawaiian bobtail squid euprymna scolopes and observing their adherence to symbiotic and non-symbiotic bacteria

Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Die symbiotische Beziehung zwischen den Hawaii-Bobtail Tintenfisch,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Und die Biolumineszenz Bakterium<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Hat als Modellsystem für das Verständnis der Auswirkungen von nützlichen Bakterien auf tierische Entwicklung genutzt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Makrophagen-ähnliche Blutzellen, die einzige zelluläre Komponente des Tintenfisches Host angeborenen Immunsystems, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen bei der Vermittlung der Einrichtung und Unterhaltung des Vereins. Dieses Protokoll wird zeigen, wie Blutzellen erhalten Sie bei<em&gt; E. scolopes</em&gt; Und verwenden Sie dann diese Zellen in bakteriellen Bindungsassays. Adult Tintenfische sind zunächst betäubt, bevor Hämolymphe wird mit einer Spritze von der Hauptstraße cephalica Blutgefäß gesammelt. Der Gastgeber Blutzellen, in der extrahierten Hämolymphe enthalten sind, zu chambered Deckgläser aufgeklebt und dann auf grün fluoreszierende Protein-markierten symbiotische ausgesetzt<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Und nicht-symbiotische<em&gt; Vibrio harveyi</em&gt;. Die Blutzellen werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cell Tracker Orange, Invitrogen) gegengefärbt und anschließend visualisiert Fluoreszenz-Mikroskopie.

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Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Dieses Video wird zeigen, wie Blutzellen (Blutkörperchen) aus dem hawaiianischen Bobtail Squid zu erreichen,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Für den Einsatz in zellbiologischen und bakterielle Adhäsion Assays. Blutzellen wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt werden und ausgesetzt GFP-markierten Bakterien.

Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

obtaining-hemocytes-from-hawaiian-bobtail-squid-euprymna-scolopes

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

13.1K Aufrufe.  University of Connecticut. Dieses Video wird zeigen, wie Blutzellen (Blutkörperchen) aus dem hawaiianischen Bobtail Squid zu erreichen, Euprymna scolopes Für den Einsatz in zellbiologischen und bakterielle Adhäsion Assays. Blutzellen wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt werden und ausgesetzt GFP-markierten Bakterien.