共聚焦激光扫描显微镜对脱细胞苹果衍生支架的孔径测量和细胞分布分析

首先，用磷酸盐缓冲盐水清洗脱细胞的苹果支架。对于孔径测量，将支架在一毫升 10% calcofluor 白色溶液中在室温下在黑暗中孵育 25 分钟。用PBS清洗支架后，使用高速共振共聚焦激光扫描显微镜并设置激光发射滤光片配置。

手动调整激光功率和探测器，以确保最佳图像采集。以 5 微米的步长获取 20 张图像的 Z 堆栈。接下来，在 ImageJ 软件中，使用 Z 投影到最大强度功能创建图像并应用查找边缘功能来突出显示孔隙的边缘。

使用徒手选择工具手动追踪毛孔。将每个孔拟合为椭圆并测量长轴的长度。编译所有测量值并计算平均长度。

为了分析细胞分布，在用PBS洗涤在适当培养基中培养的细胞接种支架三次后，用4%多聚甲醛固定10分钟。然后用去离子水彻底清洗每个支架，用Triton X-100溶液透化细胞五分钟，然后再次用PBS洗涤。将支架在一毫升 1% 高碘酸中孵育 40 分钟，然后用去离子水冲洗。

然后将支架完全浸入一毫升染色溶液中，使支架孵育。用PBS清洗支架，并通过将支架在每毫升5毫克的DAPI溶液中在黑暗中孵育10分钟来染色细胞核。再次彻底清洗并将支架存放在 PBS 中。

使用此处显示的设置，用高速共振共聚焦激光扫描显微镜以 10 倍放大倍率对细胞播种的支架进行成像。手动调整激光功率和探测器，以确保最佳图像采集，并以 5 微米的步长获取 20 张图像的 Z 堆栈。然后使用 ImageJ 软件处理共聚焦图像，并使用 Z 投影到最大强度函数在 z 轴上创建最大投影以进行图像分析。

共聚焦显微镜图像的定量显示孔径分布在 73 至 288 微米之间，平均约为 154 微米。大多数孔隙在 100 到 200 微米之间。在分化培养基中培养后，在支架中观察到矿物质沉积物。

细胞播种的支架显示出不透明的白色，表明存在矿化作用，这在空白支架中没有观察到。此外，共聚焦激光扫描显微镜分析显示支架内的细胞分布均匀。