用于蛋白水解组蛋白肽分析的LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS方法

为了开发用于分析蛋白水解组蛋白肽的LC-TIMS ToF MS/MS方法，将配备C-18色谱柱的HPLC与具有专有无源技术的商用TIMS ToF MS仪器相结合。接下来，将纳米电喷雾电离操作条件设置为 4、500 伏毛细管电压、800 伏端板偏移、三巴雾化器压力、每分钟 10 升干气和 200 摄氏度干加热器。将 MS 设置配置为 6 电子伏特碰撞能量、1200 VPP 碰撞射频、75 微秒传输时间和 5 微秒预脉冲存储。

将进样体积调节至20微升，对应于8微克样品，并将流速设置为每分钟0.4毫升。输入指定的梯度时间线并以 0.1% 甲酸百分比进行乙酮试验后，在两个弹出框中选择确定以保存方法。使用水和乙腈（均含 0.1% 甲酸）运行 60 分钟的非线性 LC 梯度。

验证样品在正电离模式下通过纳米电喷雾电离从HPLC洗脱到TIMS ToF。要在 MS-Digest 工具下识别肽序列和修饰位点，请使用 Protein Prospector 生成肽的理论列表。然后，考虑酶解条件、翻译后修饰类型、肽大小范围、质量检测范围和潜在的漏解次数进行理论酶解。

为了分析采集的数据，搜索每个理论肽在多个电荷态（从正一到加四）下的质量数。确定每个质荷比后，选择峰并使用基于肽序列的碎裂离子理论列表确认MSMS。包括翻译后修饰。

肽的片段化谱揭示了三种不同的肽变体，这些肽在不同位置具有不同的转录后修饰，包括丙酰基和乙酰基。丙酰化组蛋白 H3 标准品的肽比未修饰版本更长。从HeLa S3细胞中提取的组蛋白在相同的氨基酸位置显示出多种翻译后修饰模式。