首先，用一把镊子捡起沙门氏菌感染的小鼠组织的解冻样本。将其快速插入含有液体琼脂糖的塑料模具底部。聚合完成后，使用手术刀从角落打开塑料模具。
将刀片放在切片机上后，用戴手套的手指将样品转移到样品盒中。将样品放置在切片机下方，使琼脂糖的上表面与切片机的刀片处于同一水平。移动载物台，将琼脂糖立方体放在物镜的中心。
单击断层扫描仪软件中的“切片”按钮，直到获得立方体的整个完整切片。接下来，将物镜在 x 和 y 方向上对准组织样品。启动激光器软件，将波长调整到 800 纳米，然后打开激光器。
关闭显微镜的柜门。然后关闭房间内的所有光源。打开 PMT 并将电压设置为 750 伏。
现在将显微镜快门设置为自动。然后将 V1 和 V2 的电压分别设置为 20 和 1.71。使用 z 压电陶瓷设备调整 z 轴，直到它到达组织表面。
切割 50 微米厚度的多个切片。接下来，为了找到样品边缘，将成像区域限制在组织上，对周围琼脂糖的成像最少。关闭 PMT 后，将激光波长设置为 800 纳米。
使用激光光斑找到组织边缘的坐标，同时移动载物台。确认坐标后，将激光光斑放置在右前方中心。现在将波长更改为 940 纳米。
将显微镜快门设置为自动模式，然后将 V1 的快门电压设置为 20，将 V2 的快门电压设置为 1.71。按 3D 马赛克设置选项开始扫描。成像后，从水箱中收集组织切片。要拼接瓷砖图像，首先将数据从断层扫描仪服务器传输到 Linux 计算机。
打开 MATLAB 脚本 StepOneStitchingAndArchive。m 并找到源文件夹。切换到 Editor 选项卡，然后单击 Run。
进度信息将显示在命令窗口中。在源文件夹中名为 stitchedimages_100 的子文件夹中找到拼接的图像。使用 tar 命令压缩原始数据，并将其另存为文件扩展名为 tar.bz2 的单个文件。
要训练支持向量机，请预览拼接的图像。从带有 Fiji 的每个子文件夹中打开一个具有相同文件名的图像。将三个通道合并为一个彩色图像，然后调整每个通道的亮度，直到看到来自细菌和组织自发荧光的清晰信号。
注意每个通道调整后的最大强度级别。接下来，打开 MATLAB 脚本 StepTwoSegmentationAndAnalysis.m。定义用于训练的源文件夹和图像名称，然后转到 Editor 选项卡并单击 Run。
当出现要求颜色阈值的对话框时，使用基于先前与 Fiji 的手动检查的值填充该对话框。根据对话框选择背景区域和感兴趣的区域。将显示图表，显示模型的训练情况，并询问是否需要添加更多区域。
添加更多感兴趣区域和背景区域，直到可以清楚地分割细菌。分段过程将自动运行，并且可以在命令窗口中查看进度。接下来，打开蓝色通道图像，其中包含胶原蛋白的二次谐波信号。
在 x 轴和 y 轴上将第一个通道图像弯曲十倍，并将缩小的图像保存在新文件夹中。在同一文件夹中对缩小的图像进行三次复制。对于 3D 可视化，在 Arena 视图中启动 Imaris 可视化软件包。
现在打开 IMS 或 TIF 文件。在显示调整窗口中调整不同通道的颜色表示。单击“编辑”菜单下的“图像属性”以手动设置最小值或最大值以及 Gamma 校正的值。
调整图像外观后，使用快照工具导出当前视图。使用导航指针查找视图，然后使用加号“添加”添加关键帧。使用“动画”图标将 3D 数据表示为影片。
按红色录制按钮构建电影，然后将其保存在所需的目标文件夹和文件类型中。在整个小鼠器官中检测到单个沙门氏菌细胞，例如脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结和 Peyer 斑块。荧光菌的分割通过免疫组化证实。
在灌注之前，通过向表面标记物注射抗体在体内对宿主细胞进行染色。
