JoVE Journal

Biochemistry

需要订阅 JoVE 才能查看此.

live

Speed

×

MEDIA_ELEMENT_ERROR: Format error

尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE),用于使用市售寡核苷酸探测 DNA 酶活性

副本

首先,准备 20% 丙烯酰胺、七摩尔尿素和 1X TBE 溶液的储备液。对于一粒凝胶,将 10 毫升丙烯酰胺和尿素溶液与 100 微升 10% 过硫酸铵和 3 微升四甲基乙二胺混合,然后将其浇铸到凝胶灌注器中。凝胶凝固后,将凝胶在 1X TBE 缓冲液中以每块凝胶 10 毫安的浓度预电泳 30 分钟,并进行外部加热。

使用巴斯德移液器,将 1X TBE 冲洗到凝胶孔中,以去除过量的尿素。每个反应上样 10 μL,并在 45 至 55 摄氏度下运行 1 至 1.5 小时。使用所选荧光基团的正确设置观察凝胶。

最后,使用 ImageJ 量化产品和基材的条带强度,并使用公式计算产品的百分比。DNA 连接酶活性导致在尿素 PAGE 凝胶上观察到的寡核苷酸大小从 20 个核苷酸增加到 40 个核苷酸。细菌 DNA 连接酶可连接带切口和错配的 DNA 底物,并且可以利用镁和锰进行连接活性,但首选镁。

我们使用 cookie 来增强您在我们网站上的体验。

继续使用我们的网站或单击“继续”,即表示您同意接受我们的 cookie。