使用改良的酶联免疫吸附测定法检测和定量人血浆中的降钙素基因相关肽 （CGRP）

这种改进的ELISA方案允许纯化和准确定量人血浆中的CGRP。它经过了必要的验证实验，可用于标准化未来的定量方法。该协议的优点包括在显着蛋白酶降解之前进行样品处理，通过固相萃取纯化，以及通过将封闭缓冲液应用于微量滴定板来限制非特异性结合。

CGRP在偏头痛的病理生理学中起着惩罚性作用，并且可能是生物标志物状态的候选者。它还与心脏病、皮肤病、病毒甚至 COVID-19 相关疾病过程有关。首先，通过标准静脉穿刺方法从肘前静脉收集 5 毫升全血到 6 毫升真空容器 EDTA 管中。

为了阻断目标肽的裂解，加入0.5毫升抑肽酶竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂。将试管倒置 10 次并将其存放在冰上，直到下一步。然后将试管在600 4g下在4摄氏度下离心四分钟。

并将血浆级分转移到2毫升圆底无菌冷冻瓶中。立即将冷冻瓶存放在零下 80 摄氏度下长达两周。为了提取血浆样品，将提取盒放入15毫升锥形离心管内。

将 5 毫升 100% 甲醇，然后 10 毫升超纯水通过墨盒以激活它。流体在通过重力驱动流通过滤芯时将被收集在管中。处理积聚的多余液体，以防止其吞噬墨盒，并确保其在实验过程中不会变干。

将250微升血浆稀释在750微升4%乙酸中，然后缓慢通过滤芯。然后用10毫升乙酸清洗墨盒。去除多余的液体后，将滤芯转移到新的 15 毫升锥形离心管中。

准备3毫升甲醇乙酸溶液，洗脱降钙素基因相关肽或CGRP。将 1 毫升通过小柱，并在每次洗脱之间等待 25 分钟。最后一次洗脱后，试管中含有3毫升总洗脱液。

将1毫升淋洗液转移到1.7毫升微量离心管中，并在小型离心机中旋转一秒钟以沉淀洗脱液。然后在1， 400 RPM和4摄氏度的真空离心机中干燥样品。在测定前，立即用解冻的酶免疫测定或EIA缓冲液复溶干燥的样品。

对于板封闭，向每个孔中加入250微升TBS鱼明胶封闭缓冲液。将盖板放在板上，在室温下孵育两个小时。孵育后，取下盖板并通过倒置清空板。

然后在纸巾上吸干板以丢弃任何痕量液体，并在层流罩中干燥10分钟。一旦板明显干燥，将其放入带有硅胶干燥剂小袋的抓握密封铝箔袋中。将其存放在零下20摄氏度下24小时。

在进行测定之前，在室温下解冻所有样品和制备的试剂。要冲洗块板的孔，请加入300微升洗涤缓冲液并静置30秒。然后丢弃洗涤缓冲液并重复冲洗五次。

最后一次冲洗后，如前所述吸干板。接下来，将100微升EIA缓冲液分配到专用的两个非特异性结合或NSB孔中。加入100微升CGRP标准品，然后将重组样品和质量控制一式两份放入适当的孔中。

向每个孔中加入100微升CGRP示踪剂，空白孔除外。最后，使用透明盖板密封板，确保样品和试剂不会蒸发，并将板在 16 摄氏度下孵育 20 至 4 小时。潜伏期结束后，按照制造商的说明准备Ellman试剂。

板倾析后，按照先前演示的方式清洗每个孔三次。最后一次冲洗后，以 120 RPM 摇动板两分钟。再次，冲洗盘子三次并将其吸干。

轻敲倒置板，直到液体明显从孔中取出。然后将200微升Ellman试剂加入除空白孔以外的每个孔中。盖上平板后，将其包裹在铝箔中以防止任何光照，并在室温下在黑暗中孵育一小时，然后再记录吸光度。

本研究表明，添加封闭步骤后，各CGRP加标样品的回收率均在可接受的范围内。然而，当排除封闭步骤时，非特异性结合导致回收率超过125%的上限重要的是在收集后不久添加抑肽酶以保存血液样本以限制CGRP降解。此外，应在进行ELISA之前将封闭缓冲液添加到微量滴定板上，以进一步减少非特异性结合。

因此，该协议可用于通过量化偏头痛和前庭性偏头痛血浆患者与对照组的CGRP水平来探索CGRP作为前庭性偏头痛生物标志物的候选性。