首先，将制备凝胶电泳所需的试剂放在工作平台上。将 Tris/硼酸盐/EDTA 或 TBE 添加到琼脂糖中，并在微波炉中加热溶液。然后，将 0.4-0.5% 琼脂糖倒入灌注盘中，制备第一维琼脂糖凝胶，并使其凝固 1 小时。
凝固后，将分子量标准加载到相对于凝胶最左侧边缘的前 3 厘米内。然后加载用限制性内切酶消化的 DNA 样品，确保每对之间保持 3 cm 的距离。将凝胶以每厘米 0.85 伏特的温度在 TBE 中运行 19-24 小时，以按大小分离中间体。
第二天，从缓冲液中取出凝胶。切除含有分子量标准品的凝胶的前 3 厘米。在含有 0.3 μg/mL 溴化乙锭的 TBE 中对凝胶片段染色 10-15 分钟。
然后使用凝胶成像系统对分子量标准进行可视化。在琼脂糖凝胶上，向估计位置添加 1.3 厘米，得到 A 值，然后从值 A 中减去 7.5 厘米，得到值 B.将尺子对准第一维凝胶，并在值 A 和 B 处水平切割，然后垂直切割为每个样品保留的 3 厘米空间。在新的铸造托盘中，顺时针旋转段并将它们放置在样品孔的位置。
在 TBE 中制备浓度为 1-1.3% 的第二维琼脂糖凝胶，每毫升溴化乙锭为 0.3 μg。加热凝胶，冷却至约 55 摄氏度后，将其倒在旋转的第一维段上。让凝胶凝固 1 小时。
凝固后，将凝胶转移到含有 0.3 μg/mL 溴化乙锭的 TBE 的腔室中，并使其平衡 30 分钟。盖上凝胶，在 4 摄氏度下以每厘米 4.23 伏特的电压运行 9-10 小时。从腔室中取出第二维凝胶，在 0.24 摩尔盐酸溶液中轻轻摇动，将 DNA 片段脱嘌呤 10 分钟。
用去离子水冲洗凝胶，并将其浸泡在 0.4 摩尔氢氧化钠中 10-15 分钟。然后将两张长片色谱纸垂直折叠在玻璃片上，延伸到容器中。要组装 Southern 印迹，请在容器中加入 1 升 0.4 摩尔氢氧化钠。
将一块长玻璃板与容器对齐。用氢氧化钠润湿纸张顶部，并小心去除其表面下的任何气泡。用氢氧化钠浸泡三张色谱纸，然后将它们放在文件夹纸上。
去除所有气泡。将第二维凝胶倒置并将其放在色谱纸上。用去离子水润湿带正电荷的尼龙膜，然后将其放在凝胶上。
然后将三张用去离子水湿润的色谱膜片放在膜上。用保鲜膜覆盖容器中任何暴露的氢氧化钠，以防止蒸发。将一叠 0.3-0.5 米高的餐巾纸或纸巾放在印迹上。
用重物压缩整个印迹，以促进紧密的毛细管作用，并放置两天，以便将 DNA 转移到膜上。
