首先，取汇合度为 60% 至 70% 的培养的 U2OS 细胞，并使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 将它们分开。通过添加圆形 13 毫米盖玻片来制备 60 毫米板。将 400， 000 个细胞接种在包含多个 13 mm 圆形盖玻片的 60 mm 板中。
然后，从板中取出培养基。加入含有 25 微摩尔依托泊苷的培养基，并将细胞孵育 20 分钟、1 小时和 3 小时。孵育后，从板中取出培养基。
用 PBS 洗涤细胞 3 次。要固定细胞，请加入足够体积的冰冷甲醇以覆盖盖玻片表面，并在 20 摄氏度下孵育 10 分钟。然后，用 PBS 清洗盖玻片 3 次，并将其转移到湿度室中。
敲掉 PBS 后，加入 30 至 40 μL 透化缓冲液，并在室温下孵育 20 分钟。之后，用 PBS 清洗盖玻片 3 次。然后，从样品中敲击 PBS。
将 PLA 试剂盒中提供的 30 至 40 微升封闭溶液添加到每个盖玻片中。将板在 37 摄氏度的预热湿度箱中孵育 1 小时。现在，在试剂盒中提供的抗体稀释剂中稀释一抗。
敲掉封闭溶液后，将一抗溶液添加到每个盖玻片中，并在 4 摄氏度下在湿度室中孵育过夜。在抗体稀释剂中稀释 minus 和 plus 探针 1 至 5。使用驴防鼠 MINUS 与 驴防山羊 PLUS 和驴防鼠 MINUS 与 驴防兔 PLUS 的组合。
现在，轻弹一抗溶液并用 TBST 洗涤一次。敲掉多余的 TBST 后，向盖玻片中加入 20 微升 PLA 探针溶液。然后，在预热的湿度箱中以 37 摄氏度孵育 1 小时。
用高纯度水稀释 5x 连接缓冲液。轻弹 PLA 探针溶液并用 TBST 洗涤一次。现在，在将连接酶应用于样品之前，立即以 1：40 稀释的比例将连接酶添加到连接溶液中。
在 37 摄氏度的预热湿度箱中孵育 30 分钟。接下来，用高纯水稀释 5x 扩增缓冲液。从样品中取出连接溶液后，用 TBST 洗涤样品一次。
在将聚合酶应用于样品之前，立即将聚合酶以 1：80 稀释度添加到扩增溶液中。在预热的湿度箱中以 37 摄氏度孵育 100 分钟。弹掉扩增缓冲液，然后用 SSC 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。
用 PBS 洗涤样品两次后，将一抗溶液添加到每个盖玻片中，并在室温下孵育 1 小时。孵育结束时，轻弹一抗溶液并用 TBST 洗涤 3 次。然后，将二抗溶液添加到每个盖玻片中，并在室温下孵育 20 分钟。
之后，用 TBST 洗涤 5 次，用 SSC 缓冲液洗涤 2 次，用 0.01x SSC 缓冲液洗涤 2 次。最后，从不同的孔或盖玻片区域采集图像，以避免由于非均匀孵育而导致的伪影，并保存具有相同名称模式的所有通道。
