首先,从植物组织中提取 DNA 并确定 DNA 浓度。将所有必需的组分添加到 0.2 mL 离心管中后,构建反应。引物扩增后,将 3 μL PCR 产物和 2 μL 5, 000 碱基对 DNA 标记物上样到琼脂糖凝胶的孔中。
将电压设置为 120 伏,电流为 400 毫安,然后运行电泳 40 分钟。使用多功能凝胶图像分析系统查看和分析凝胶结果。通过测序单元运行样本后,选择 Create a New Project,然后单击 Okay 进入软件主页。
在 File 菜单下,选择 Import and Add Samples。选择序列轨迹格式文件,并将其作为要在未组装样品下处理的文件导入。选择 Contig。
然后转到 Advanced Assembly 并选择 Assemble in Groups。当出现提示定义名称的对话框时,在 define sample name parts 部分中修改文件名,然后单击 Assemble 以显示对齐的序列。选择 Go,然后选择 Search Sequence 并单击 Okay 以查找匹配的序列。
选择 Contig,然后选择 Delete 以删除 5.8S 和 28S 区域以及任何低质量序列。导出带有拼接序列的输出以进行匹配。使用 NCBI 的核苷酸数据库选择 BLAST 搜索。
选择与全球药典基因组数据库相对应的物种鉴定工具和特异性引物 ITS-2。从 NCBI 下载三种当归和一种 Peucedanum praeruptorum 的序列作为外群。分析这些序列以及获得的结果序列。
然后单击 File(文件)。选择 Open a File or Session 以导入文件,然后会出现一个对话框。选择 Align 后跟 DNA,然后选择 Align by ClustalW 进行序列比较。
导航到系统发育,然后单击 Construct Test Neighbor Joining Tree 以生成系统发育树。凝胶电泳结果显示样品 AS1、AS2 和 AS3 在 500 个碱基对附近出现单个清晰条带,阴性对照中没有条带,表明提取的 DNA 扩增成功。测序结果使用 BLAST 鉴定出序列相似性为 100% 的 Angelica sinensis,与 GPGD 数据库的结果相匹配。
在系统发育分析中,与 Angelica sinensis 聚集的剪接序列为 OR8797150.1,bootstrap 支持值为 100,证明其身份为 Angelica sinensis。