量化草甘膦产品对微生物组的潜在影响

在这里，我们提供了一个工作流程，其中包括最佳的生物信息学方法，以进行实验以评估草甘膦对微生物组的影响。主要优点是它为未来的现场和实验室实验提供了一个强大的可测试假设。所描述的方法可以应用于各种系统，包括植物，动物和微生物。

该方法的每个部分都非常简单。也许最具挑战性的部分是整合一个能够执行不同部分工作的多学科团队。演示该程序的将是来自我实验室的研究员Suni Matthew。

首先，通过将实验场划分为10个对照和GBP处理的重复，并在样块之间使用植被缓冲条来开始实验。用自来水处理对照地块，用商业GBP处理GBP地块，以模仿农业实践中允许的最大草甘膦剂量。从实验植物中取样微生物群。

从田间收集10个复制的植物样品，立即将它们放在冰上并将它们带到实验室进行进一步处理。对于实验二，在为期12个月的鸟舍实验中收集垫料，包括木屑，粪便和一些来自鹌鹑的溢出饲料，这些鹌鹑以GBP污染或对照饲料喂养。将铺垫样品送到认可的实验室，以便在铺展后立即测量草甘膦浓度。

在每个地块种植多年生草和草莓植物，以研究其根和叶微生物群。通过洗涤和灭菌植物样品来鉴定和去除内生微生物。一旦样品被灭菌，按照制造商的协议，使用市售的植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

使用嵌套方法，扩增16S rRNA基因的可变区域V6至V8，并如文本手稿中所述，为所需数量的样品制作PCR预混液。对于第一轮PCR，使用引物799正向和1492反向。在热循环仪中设置35个循环的扩增曲线。

为了验证扩增，使用5微升扩增产物进行电泳，然后以1比10的比例将PCR产物的其余25微升稀释在高压灭菌的超纯水中。使用通用引物1062正向和1390反向，以25个周期进行第二轮扩增。以相等的比例在高压灭菌的超纯水中稀释所得的PCR产物。

以八个周期进行第三轮放大，用条形码和P1适配器序列标记产品。在生物分析仪上验证PCR产物的质量浓度，并将每个样品的30纳克DNA体积池化在1.5毫升管中以制备等摩尔文库。使用琼脂糖凝胶盒上的自动DNA尺寸选择系统，通过尺寸分馏选择大小为350至550个碱基对的扩增子。

将含有指定大小的扩增子的洗脱液收集到盒中的小瓶中，从而获得纯化的16S rRNA基因文库。将收集的淋洗液转移到1.5毫升管中，并验证生物分析仪上的纯度和浓度。使用高压灭菌的超纯水稀释DNA文库至终浓度为26皮摩尔。

为了扩增ITS区域，在用ITS引物建立反应后，在热循环仪上设置扩增曲线。然后在1.5%琼脂糖凝胶上分析5微升扩增产物，并使用高压灭菌的超纯水以1比10的比例稀释剩余的25微升产物。使用条形码标记的正向引物和 P1 适配器标记的反向引物制作所需数量样品的 PCR 预混液。

以稀释后的PCR产物为模板，进行第二轮扩增。与16S rRNA基因的文库制备类似，为纯化的ITS区制备文库。启动EPSPS蛋白序列的生物信息学分析。

评估查询序列对草甘膦的潜在敏感性，从服务器提供的输出中输出一显示查询序列中存在的氨基酸标记物的分数和基序的数量。输出 2 显示基于标记残留物的查询和参考序列的对齐方式。输出 3 显示查询和引用序列的完整成对对齐。

输出 4 显示了霍乱弧菌、贝氏柯克斯体、水疱性短链霉菌和达瓦氏链霉菌的 EPSPS 参考序列。在输出页面的末尾，查找指向外部工具（如 BLASTp 和保守域）的链接，以进一步分析查询 EPSPS 序列。从公共存储库中识别 EPSPS 序列后，从包含分类信息和超过 50， 000 个序列的 EPSPS 类的主页面访问这些数据集。

在田间季节结束时称量植物的地上生物量，以比较植物的生长（以英镑为单位）和控制地块。在电子表格中，将用于微生物组实验的细菌 OTI 映射到预先计算的数据集中。根据概率评分，计算对草甘膦的内在敏感性。

该方法用于在微观进化水平上量化EPSPS蛋白灵敏度的变化。在所分析的32组密切相关的原核生物中，有12组确定了敏感性状态的变化。因此，基于草甘膦的产品的连续使用可能会在植物，动物和土壤微生物组中产生微生物生态失调。

确保PCR前和PCR后程序的质量，以获得最佳的扩增子文库。在使用软件之前，还要确保EPSPS蛋白序列不是部分的。在现场实验中，确保防止草甘膦污染对照。