巴顿得到了达蒙Runyon癌症研究基金会奖学金DRG - 1716 - 02。锦州是支持由美国国立卫生研究院/ NIGMS奖学金F32 GM082174 - 02。 NP是霍华德休斯医学研究所研究员。

1。准备蝇笼<ol><li>生长在方便的容器，如32盎司昆虫杯果蝇（野生型菌株，如俄勒冈- R或任何基因型）。 </li><li>新eclosed苍蝇大的胚胎回收笼，或飞人口笼。 </li><li>一个房间移动到笼子里的温度〜25 ° C，湿度〜65％在12小时轻和黑暗的12小时周期，以方便收集同步胚胎。 </li><li>维持在笼子里的苍蝇喂养它们杀死酵母膏挑染糖蜜板。糖蜜板（死亡人数酵母膏）为2-3天更换一次D. </li></ol> 2。收集同步胚胎<ol><li>在原细胞制备的一天，饲料苍蝇杀害酵母WTH新鲜涂层钢板为1-2 h前奠定期间粘贴。 </li><li>就在12小时黑暗周期，更换新鲜糖蜜与少量的酵母膏挑染板前打下板。丢弃前打下的集合，它包含异步年纪较大的胚胎。 </li><li>收集胚胎期为1-2小时。 </li><li> 5-6小时取出板含有胚胎和存储相对同步的人口在25 ° C胚胎将在先进的原肠胚阶段，在这个时候。 </li></ol> 3。胚胎收集和洗涤<ol><li>松开的胚胎，用湿画笔板块，并通过一个筛子叠不温不火的自来水彻底冲洗，使胚胎在底部收集最好的目筛。冲洗几分钟，以消除尽可能多的酵母和飞行碎片。 </li><li>提示的筛子，使胚胎在一侧积累，并轻轻从筛洗成dechorionation筐。 </li><li>移动到组织文化引擎盖区，而让胚胎干出。 </li></ol> 4。同质化的胚胎和细胞电镀<ol><li>他们沉浸在50％（体积/体积）5-10分钟漂白消毒和dechorionate胚胎。篮子的墙上用清水冲洗干净，用70％乙醇（体积/体积）的胚胎。另外，用蒸馏水洗净漂白乙醇治疗前关闭胚胎。从这一点起胚胎应在无菌条件下和在组织培养罩处理。 </li><li>冲洗胚胎彻底灭菌蒸馏水中删除的漂白剂和/或乙醇。 </li><li>在dechorionation步骤，填写一个Dounce匀浆，室温供应M3的介质的基础上，胚胎数量适当的音量。之间的胚胎数量和比例的媒体不应该超过0.5毫升胚胎：40毫升介质（或约100-200胚胎/毫升）。 </li><li> M3的媒体的数量足以淹没胚胎放置在灭菌烧杯冲洗胚胎。让胚胎浸泡2-5分钟。 </li><li>拆开dechorionation篮子和印迹Nitex网状消毒纸巾擦干。 </li><li>胚胎转移到均质，灭菌画笔。 </li><li>均质轻轻短行程而深远的试管底部，直到所有的胚胎暂停使用一个松散的杵。然后轻轻地，但坚定地，同质化八分满招。杵为向上和向下移动，不要扭曲。 </li><li>通过浇注或移液匀浆转移到无菌的50毫升锥形离心管，并帽管。 </li><li>离心10分钟40G，室温组织碎片，大颗粒细胞团块和卵黄膜。转移上清到一个干净的管含有细胞和蛋黄和重复离心5分钟步。 </li><li>小心地浇或360克在10分钟到一个干净的管和自旋吹打，室温颗粒细胞转移上清。上清液。悬浮在10毫升培养液中的细胞沉淀（RNAi实验的无血清培养基）。 </li><li>使用血球估计细胞密度的活菌计数。同时，重复步骤4.10颗粒细胞。 </li><li>悬浮细胞至所需浓度。要启动，请尝试范围是1〜5 × 10 6细胞/ ml和板在1.7至2.5 × 10 5细胞/厘米2。 </li></ol> 5。在384孔板细胞生长的主要细胞的RNAi <ol><li>免除到每口井在〜250纳克在384孔板，每孔终浓度为5μLdsRNAs。 </li><li>使用多道移液器，免除每口井的主要细胞在无血清M3中型384板，包含在每口井的不同的双链RNA的10毫升（1〜4x106细胞/ ml）。此外，细胞可以培养8以及玻璃共焦成像玻片。 </li><li>离心机板300G，室温1分钟。培养细胞无血清培养基在25 ° C为22小时或18 ° 1-2彗星D. </li><li>含血清培养基中加入30毫升，每口井。 </李&gt; <li>离心机板300G，室温1分钟。 </li><li>板放置在潮湿室和文化的主要细胞为额外的5〜7天在25 ° C。 </li><li>图片的细胞免疫荧光染色后的活。 </li></ol> 6。代表性的成果： 在最佳条件下，在文化的细胞看起来很健康的，圆的形态。文化将有小细胞碎片，并且50〜80％融合后初步电镀。这些细胞经过长时间培养后的形态学变化。它通常需要5-8天左右的文化细胞得到充分分化在25 ° C。优质的小学文化通常是判断细胞的利益如何在文化区别。例如，小学的肌肉细胞往往有分支状的形态，并成为与条纹状的肌系列组成的肌原纤维的多核肌管。完全分化的肌管通常会自发地在文化移动。相反，差异化的初级神经元形成的细胞体的集群，其轴突电缆连接与其他集群。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。主细胞进行形态学变化后，在文化镀 （A）原代细胞的明场像，后在384孔板以及镀。多数细胞是全面和完整，并很好地分离。 （B）原代细胞培养20小时后镀亮场图像。原代细胞已经形成集群（大箭头）的一个分支状的形态（长箭头），可以在此阶段的肌肉。 （三）一个小学文化的形象相衬，电​​镀后5天。看起来更先进的文化，与神经元扩展（小箭头），神经元簇（大箭头）和肌肉（中型箭头）。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。 dsRNAs治疗原发性细胞培养在384孔板 从账面Dmef2 - Gal4的胚胎，D42 - Gal4的，UAS的线粒体GFP转基因，其中Dmef2 - Gal4的D42 - Gal4的线粒体GFP的驱动器在肌肉和运动神经元的表达，分别为原代细胞中分离。针对要么lacZ基因（AC）或膨胀（如果）（DF）的dsRNAs细胞治疗。小学的肌肉和神经元可以看出，绿色荧光蛋白（A，C，D，F）。白色箭头指向神经扩展。鬼笔环肽染色显示肌动蛋白（箭头）在lacZ的dsRNAs（B和C）治疗文化的一个分支状的肌肉结构，但在文化的全面肌肉形态如果治疗dsRNAs（E和F）。在合并后的图像（C，F），肌肉都染成黄色，但红色的负面显示神经元及其扩展（白色箭头）。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="图3" /> 图3。人类vitronectin涂盖玻片上培养的主要肌肉的共焦显微 主要肌肉immunofluorescently染色抗果蝇肌联蛋白（KZ）（红色）在合并和鬼笔环肽与肌动蛋白（在合并中的绿色）。顶部面板的野生型控制肌肉和底部的课后（CG31374）的RNAi缩短肌的肌肉。

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	<li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory culture of Drosophila. , 588-599 (1999).</li><li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+WH2-domain-containing+protein,+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth.">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li><li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+.">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro.">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li><li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae.">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li><li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening.">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li></ol>

果蝇细胞的原代培养的发展模式可以相差很大，可能是由于在主细胞制备过程中的几个变量。首先，苍蝇产卵应该是年轻的（在一个星期内老）和健康（无病毒或细菌感染）。未受精或受感染的胚胎必须避免，因为他们是无用的，从这些胚胎来源的细胞不能区分，将只能存活1-2天。其次，在同质化过程中，重要的是不超载太多的胚胎匀浆。匀浆超载太多的胚胎，会导致碎片和死细胞，最终...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Shields and Sang M3 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3652</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JRH Biosciences</td>
<td>12103-500M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin from bovine pancreas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-6634</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large embryo collection cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#25 US standard testing sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>57334-454</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#45 US standard testing sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>57334-462</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#120 US standard testing sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>57334-474</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>62400-620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT885300-0040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT885300-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Costar, 384-well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>29444-078</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered coverglass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>171080</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primary cell cultures from drosophila gastrula embryos

在这里，我们描述了一个准备从果蝇原肠期胚胎和培养原代细胞分离的方法。总之，大量上演来自年轻和健康的苍蝇的胚胎收集，消毒，然后身体成单细胞悬浮液，使用玻璃匀浆分离。镀合适的密度，在培养基中培养板或玻片上后，这些细胞可以进一步分化成几种形态不同的细胞类型，可以通过其特定的细胞标记鉴定。此外，我们目前的治疗与双链（DS）的RNA这些细胞，引起基因敲除的条件。在果蝇中的主要细胞的高效RNAi是通过简单地沐浴在培养基中含有双链RNA的细胞。开展有效的RNAi的扰动，与其他分子生物学，生物化学，细胞成像分析的能力，将允许在果蝇的主要细胞，尤其是那些涉及到分化的肌肉和神经细胞的回答各种各样的问题。

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Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

我们提供一份详细的协议，准备原代细胞脱离<em&gt; Drosophil</em&gt;一个胚胎。能够进行有效的RNAi扰动，与其他分子生物学，生物化学和细胞成像方法，将允许各种问题加以解决，<em&gt;果蝇</em&gt;原代细胞。

原代细胞培养从果蝇原肠胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

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JoVE Journal

Biology

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

13.8K 次观看.  Harvard Medical School. 我们提供一份详细的协议，准备原代细胞脱离 Drosophil一个胚胎。能够进行有效的RNAi扰动，与其他分子生物学，生物化学和细胞成像方法，将允许各种问题加以解决，果蝇原代细胞。