我们要感谢她用流式细胞仪的协助下在加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心的Abbie微调。这项研究是由国家过敏和传染病研究所（NIAID）美国国立卫生研究院（NIH）AI073745，AI080799，和AI078183提供资金支持。

<ol><li>启动协议之前，重要的是要确定，蚊子在实验中使用的细胞是健康的和〜80％汇合，如果贴壁（图1）。蔓生或不健康的细胞，会导致转染效率低，并会产生不一致的结果。 </li><li>前热身所有媒体在28℃水浴30分钟。 <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43细胞需要E5介质：MEM，厄尔的W /谷氨酰胺，5％热灭活的FCS，0.2％D -葡萄糖，1％的青霉素，链霉素抗生素，1％非必需氨基酸。 </li><li> 冈比亚按蚊 SUA5B细胞需要S2介质：施耐德的果蝇培养基，5％热灭活的FCS，1％青霉素，链霉素抗生素</li></ol></li><li>解冻，并存储在冰块中的所有材料转染试剂，质粒和寡核苷酸。 </li><li>所有程序应在组织培养罩使用无菌技术进行。 </li><li>对于贴壁细胞（ 冈比亚按蚊 SUA5B A. stephensi MSQ43）吸过旧媒体不干扰细胞的情况下，添加一个新媒体的等量已预热至28 ° C，然后用清水冲洗干净，从底部的细胞容量瓶中，用吸管。 </li><li>细胞浓度应确定和调整到终浓度为1 × 10 6细胞/ mL。准备转染试剂材料的同时，细胞可在室温下保存。 </li><li>加入1毫升每6孔板以及蚊子细胞（1 × 10 6细胞/ mL）。设置一个盘子，每个实验条件下（见下文）。 表我是一个一般的转移液方案。表二列出了五个条件来测试使用特定的BFP - LNA组件的单一核苷酸的成功诱变。前两个，pGFP和pBFP，阳性和阴性对照，分别为。其余pBFPs实验条件下，与特定的BFP - LNA - ONS浓度增加。在步骤8到12，添加适当的试剂量为每一个条件。 </li><li>质粒DNA转移到无菌的1.5 ml离心管，加入适当体积的EC缓冲区。 <ol class="lalpha"><li> 1μL质粒DNA（1微克/μL），加99μL欧共体缓冲区。 </li><li> 1μLpGFP（1μg/μL），加99μL欧共体缓冲区。 </li><li> 1μLpBFP（1μg/μL），加99μL欧共体缓冲区。 </li><li> 1μLpBFP（1μg/μL）1μL，ON（μg/μL的），加98μL欧共体缓冲区。 </li><li> 1μLpBFP（1μg/μL）和5μL，ON（1μg/μL），加94μL欧共体缓冲区。 </li><li> 1μLpBFP（1μg/μL）和10μL，ON（1μg/μL），加89μL欧共体缓冲区。 </li></ol></li><li>然后慢慢加入强化剂使用DNA每1微克。 <ol class="lalpha"><li> 1μL质粒DNA，加入8μL的增强。 </li><li> 1微升pGFP，加入8μL的增强。 </li><li> 1μLpBFP，加8μL的增强。 </li><li> 1μL，pBFP和1μLON，添加16μL的增强。 </li><li> 1μL，pBFP和5μ​​LON，添加48μL的增强。 </li><li> 1μL，pBFP和10μL，ON，添加88μL的增强。 </li></ol></li><li>涡DNA /缓冲/增强的混合物为1秒，并确保所有的解决方案是在试管底部。然后在室温下孵育5分钟。 </li><li>新增每1μg质粒DNA和10秒的旋涡Effectene试剂。确认，所有的解决方案是在试管底部，然后在室温下孵育10分钟。 <ol class="lalpha"><li> 1μL质粒DNA，加入10μLEffectene（见表一）。 </li><li> 1微升pGFP，加入10μLEffectene（表二）。 </li><li> 1μLpBFP，加10μLEffectene（表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和1μLON，加入20μLEffectene（表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和5μ​​LON，加60μLEffectene（表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和10μL，ON，添加110μL的Effectene（见表二）。 </li></ol></li><li>带给每管加入滴加DNA /缓冲/增强/ Effectene混合物加热的媒体，到1000μL的最终体积。 DNA可能沉淀在这一点上，如果媒体是增加太快。轻轻混合移液器向上和向下的3-4倍。 <ol class="lalpha"><li> 1μL质粒DNA，加882μL的媒体（见表一）。 </li><li> 1微升pGFP，添加882μL的媒体（见表二）。 </li><li> 1μLpBFP，加882μL的媒体（见表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和1μLON，添加864μL的媒体（见表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和5μ​​LON，添加792μL的媒体（见表二）。 </li><li> 1μL，pBFP和10μL，ON，添加702μL的媒体（见表二）。 </li></ol></li><li>下慢慢加入1毫升适当的DNA /增强/ Effectene混合物，每口井一次下降。 </li><li>板轻轻摇动，以确保细胞和转染混合物的均匀分布。 IncubatË细胞正常生长条件下。 </li><li>转染后的一天，轻轻地吸出媒体和慢慢取代等量的新鲜温暖的媒体。重要的是这样做时，不会干扰细胞层，在井底部。 </li><li>转染后两日内进行审查与pGFP阳性对照转染细胞，荧光显微镜下，以确定转染效率（图2）。 </li><li> SUA5B细胞生长非常迅速，将成为杂草丛生。四天后转薄这些细胞吸出旧媒体，并缓慢加入等量的新鲜温暖的媒体。 </li><li>添加新媒体的井后，从每口井的底部的所有细胞分离由pipeting上下，放弃一半的细胞混合物的体积（1毫升），并添加1毫升的新鲜温暖的媒体带来的最终体积为2毫升。 </li><li>日常检查细胞，以确定它们是健康的，而不是杂草丛生，必要薄。 </li><li>允许细胞生长正常情况下为五到七天后转染前收集分析。 </li><li>在五到七天后转，收集吸在所有井的旧媒体，每孔加入1毫升的无菌室温度PBS的细胞。 </li><li>从井底向上和向下吹打细胞分离，并转移至5 mL的管理单元第管的细胞混合，并立即通过流式细胞仪分析细胞。 </li></ol>代表性的成果<img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="图1" /> 未转染健康答： 图1。 stephensi MSQ43（A）和A.冈比亚 SUA5B（二）细胞在约80％汇合。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="图2" /> 图2：A。 stephensi MSQ43（A）和A.冈比亚 SUA5B（二）细胞的转染与阳性对照的GFP表达质粒。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="图3" /> 图3流式细胞仪检测数据，通过具体的BFP -锁定核酸修饰的寡核苷酸（LNA的ONS）以下的单核苷酸转染突变确认，BFP转换到绿色荧光蛋白。 SUA5B细胞转染与表达质粒绿色荧光蛋白（pGFP）作为阳性对照，表达质粒（pBFP）作为阴性对照的BFP，或与pBFP特定的BFP - LNA - ONS浓度的增加。 （一）从左至右流式细胞仪检测显示数据选通战略：一边向前与活细胞，碘化丙啶（PI）的阴性细胞，GFP阳性细胞5天以下转分散。 （二）图中（A）与低噪声放大器组件的pBFP和浓度的增加以下转染GFP阳性细胞的百分比。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="表1" /> 表一转染条件。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="表2" /> 表二，在图1中使用的转染条件。

<ol>
	<li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi.">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , (2010).</li><li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid+(LNA):+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA.">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li><li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs.">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li><li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li><li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons.">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons.">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li><li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae.">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li><li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population.">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li><li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region.">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li></ol>

在这里，我们目前在体外培养的方法和一个episomal基因目标有针对性地转换为一个单核苷酸的证据，A中的LNA组件的转stephensi和A 。 冈比亚细胞。 LNA - ON -介导的基因转化需要一个站点特定的DNA修复反应诱导;，我们的数据表明，蚊子细胞可以支持这个站点特定的突变机制。虽然这里介绍的方法是转换的episomal目标的基础上，我们的数据表明，低噪声放大器（LNA）的ON...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene transfection reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K4935-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LNA-ONs </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gift from Dr. Concordet3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM, Earle's w/ glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s Drosophila medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transfection and mutagenesis of target genes in mosquito cells by locked nucleic acid-modified oligonucleotides

疟原虫的寄生虫病，疟疾的病原体，导致超过250万，每年新感染者的感染按蚊蚊子叮咬传播。尽管有几十年的研究，还没有对疟疾疫苗，突出的新型控制策略的需要。一个创新的方法是使用基因改造的蚊子，有效控制疟疾寄生虫的传播。故意在蚊子的细胞信号通路的改变，通过有针对性的突变，已发现规范寄生虫的发展1。从这些研究中，我们可以开始转型，以确定潜在的靶基因。有针对性的突变历来依靠的一个靶基因和一个大的DNA分子之间的同源重组。然而，建设和使用等复杂的DNA分子稳定转化的细胞株的产生，是昂贵，费时，往往效率低下。因此，使用锁核酸修饰的寡核苷酸（LNA的组件）的战略提供了一个有用的替代引入episomal和染色体DNA基因的目标（2审查）人工单核苷酸替换。已使用的LNA - ON -介导的有针对性的突变引入点突变基因在培养细胞的酵母和小鼠3,4的兴趣。我们在这里展示，可用于低噪声放大器组件引入单一核苷酸开关按蚊和斯氏按蚊细胞在蓝色荧光蛋白（BFP）的表达绿色荧光蛋白（GFP）的表达变化，结果转episomal目标。这种转换表明，蚊子细胞中的靶基因的有效诱变可以介导的低噪声放大器组件和建议，这种技术可能适用，在体外和体内染色体目标诱变首次。

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Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

寡核苷酸，可用于网站，专门替代的转靶基因的单核苷酸<em&gt;按蚊</em&gt;<em&gt;按蚊</em&gt;细胞。

酸修饰的寡核苷酸锁定核酸转染和蚊虫细胞的靶基因突变

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K 次观看.  University of California, Davis. 寡核苷酸，可用于网站，专门替代的转靶基因的单核苷酸按蚊按蚊细胞。