使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊的功能遗传学中

二分GAL4-UAS系统是通过时空控制方式对基因表达进行遗传修饰，对冈比亚按蚊进行功能遗传分析的多功能工具。二元系统使转基因表达表型表征的实验方法具有灵活性，即使引起严重的适应性成本。该系统可用于可能涉及杀虫剂耐药性，病原体传播或用于遗传控制方法的基因的表型表征。

研究技术人员Fraser Coleman将帮助演示这一程序，首先使用三毫升塑料巴斯德移液器收集蛹，末端被切断到适合与体视显微镜一起使用的透明平盘上。小心地去除蛹周围的大部分水。打开荧光灯泡，让它变暖。

考虑在筛选荧光标记物时预期的表达的颜色时空模式和不同表型的比例。在荧光立体镜上选择所需的滤光片，并检查是否有一束可见的彩色光束指向载物台板的中心。在白光下，将蛹居中置于视野中，并将它们聚焦。

打开白光并使用精细焦点将携带具有可见荧光图案的感兴趣表型的蛹区域聚焦。使用精细的细节画笔轻轻转动蛹并移动肛门桨，以便识别外生殖器。根据独特的外生殖器将蛹分开。

雄性有一根长管，从最后的背节挤出，大约是肛门桨长度的一半。雌性蛹的外生殖器相当短且分叉。将有性化的蛹分成10个或更少的组，在透明的20毫升管中用水，并用棉絮球密封管子。

将所需数量的雄性和雌性成虫从管中吸入笼子或小桶中，注意在转移过程中不要损坏成虫。在喂血前保持十字架五到七天。第二天，可以收集卵子来研究胚胎发育。

组装产卵室，并小心地将10至15名血液喂养的雌性引入其中。盖上产卵室，静置 20 分钟。小心地将50毫升聚丙烯管从产卵罐中取出，确保不会释放蚊子。

盖上锅盖，让鸡蛋成熟到感兴趣的发育阶段。使用精细细节画笔从锅中捡起鸡蛋，并将它们放在40平方毫米的挖掘玻璃块中的水中。用微量移液器小心地从玻璃块中取出水，并将鸡蛋盖在500微升FAA中。

在室温下在轨道振荡器上轻轻振荡 30 分钟。用蒸馏水彻底冲洗鸡蛋15次，以去除FAA溶液的所有痕迹。使用1000微升微量移液管添加，然后一次除去一毫升蒸馏水，注意不要损坏鸡蛋。

用一毫升Trpis溶液覆盖固定的鸡蛋，并在室温下孵育30分钟。卵在孵化五分钟后会开始形成苍白的斑块，最终在清除后达到乳白色。用蒸馏水彻底冲洗鸡蛋15次，以去除Trpis溶液的所有痕迹。

在冈比亚按蚊蛹的眼睛和腹侧神经节中观察到由3xP3启动子驱动的荧光标记物的表达。使用不同颜色的荧光标记物可以选择和筛选携带不同GAL4和UAS组分的改良个体。当使用二分GAL4-UAS系统时，有必要交叉来自不同菌株的雄性和雌性，以获得携带GAL4和UAS组分的后代。

在蛹的男性和女性外生殖器中观察到的差异形态用于。这里突出显示了一个无法识别的蛹的例子。如右图所示，从蛹中去除所有水分会增加性交难度，因为肛门桨模糊了生殖器的可视化。

二分GAL4-UAS系统允许以受控的时空方式修饰基因表达。这可以通过将卵子细胞和无处不在的GAL4四个表达的驱动线与响应线UAS-mCherry交叉来可视化。使用二分GAL4-UAS系统的一个关键好处是即使在胚胎阶段也易于研究致命的表型。

为此，有必要可视化胚胎的内部形态。在胚胎清除方案完成后，可以在产后12，24和36小时观察到胚胎发育的不同阶段的正常形态特征。在整个过程中，不允许蛹和卵干燥至关重要。

因此，在去除液体时快速工作非常重要。GAL4-UAS方法使我们能够在功能上表征参与杀虫剂抗性的基因以及在基因驱动控制方法中具有潜在用途的基因。