使用埃及伊蚊的高分辨率熔融分析进行CRISPR/Cas9诱变后的Indel检测

该协议是一种非常简单有效的方法来检测由CRISPR / Cas9技术从众多个体中产生的突变体。这种技术的两个主要优点是它可以在几个小时内完成，并且适用于多种生物体。引物设计对某些基因来说可能具有挑战性，并且可能需要多轮引物设计和验证才能使HRMA高效。

要进行梯度PCR，请先制备预混液。然后在96孔板中除去19微升用于非模板对照或NTC的预混液。然后，将模板添加到剩余的预混音中。

将20微升样品等分到96孔板中。根据循环参数执行PCR，然后使用手稿中提到的参数生成热熔体曲线。收集所有必需的材料后，准备预混液，每人用0.5微升DNA释放试剂和20微升稀释缓冲液进行基因分型。

使用多通道移液器，将20微升的混合物等分到PCR板中，并将PCR板留在冰上。接下来，将麻醉的G1蚊子放在玻璃培养皿中以保持镇静，并将八只野生型蚊子放入第二个培养皿中。用70%乙醇擦拭一对镊子，然后用消毒的镊子去除其中一只蚊子的后腿。

然后，将腿浸没在DNA释放试剂溶液中。将蚊子放入相应的小瓶中，并用海绵关闭小瓶。完成后，用70%乙醇擦拭镊子，然后继续从下一个蚊子身上取下腿，直到96孔板完成。

之后，用光学PCR板密封板密封板，并在室温下孵育含有腿的PCR板两到五分钟，然后在98摄氏度下孵育两分钟。让板冷却至室温。对于PCR，制备含有优选组分的预混液，然后使用多通道移液管将19微升的预混液转移到96孔板的每个孔中。

在将含有先前制备的蚊子DNA的DNA释放溶液的一微升转移到板中后，用光学PCR板密封板密封板。使用适当的循环参数执行PCR，以按照手稿中描述的参数生成热熔体曲线，然后通过为参考簇分配野生型控制来检查熔体曲线。在 96 孔模板上用相应的颜色标记不同的聚类。

接下来，选择具有感兴趣曲线的个体，并从管中取出所选个体以向后交叉。血液喂养使它成为雌性，然后收集G2As。在代表性分析中，显示了埃及伊蚊ZIP11突变体的序列分析。

埃及伊蚊ZIP11杂合突变体的电泳图显示了发生凹陷的核苷酸位置。indel由从单峰到双峰的转变表示，因为多态位置同时显示两个核苷酸。在运行结束时，通过计算单个峰值来计算已删除或插入的基础对的数量。

对含有埃及伊蚊ZIP11和肌女性基因突变的蚊子进行基因分型和测序验证，利用HRMA的高分辨率熔融分析进行测序验证。样品的荧光信号被归一化为1到0的相对值。此外，从 wild 型参考中减去每条曲线，并表示相应的放大倍率。

失败的自动聚类分配显示在代表性结果中，其中未对组进行适当的区分。此外，单独分析每个样品，并根据与杂合子，纯合子和转杂合子的参考样品的相似性分配给正确的组。在执行HRMA之后，有必要对突变个体的DNA进行测序，以分析内嵌并鉴定靶序列中的其他突变。